结肠癌细胞对酸性微环境的适应及其机制研究

发布时间：2018-05-01 13:31

  本文选题：结肠癌 + 酸性微环境　； 参考：《山东大学》2016年博士论文

【摘要】：癌症正在成为人类的第一杀手。世界卫生组织(WHO)发布的《世界癌症报告,2014))中称,2012年全球新发癌症病例(1400万)以及癌症相关死亡病例(820万)均明显增加,结直肠癌在全球肿瘤相关死亡原因以及新发癌症病例中均排第三位。仅2012年,全球就有69.4万人死于结直肠癌。在我国,结直肠癌的发病率居于恶性肿瘤第三位,死亡率居于第五位,严重威胁着人类的生命。肿瘤的发生和发展并非一个孤立的过程,而是受到各种因素的影响,肿瘤微环境是最重要的影响因素之一。间质组织、细胞外基质等围绕在肿瘤细胞周围的局部环境构成肿瘤微环境。目前研究显示,肿瘤细胞微环境具有乏氧、营养物质缺乏、低pH、血管生成增多以及炎性细胞浸润等特点。肿瘤酸性微环境是指肿瘤细胞外局部环境的pH值变低的现象。肿瘤细胞主要通过糖酵解获取能量,即使在有氧条件下也如此,称为"Warburg效应”(the Warburg effect)。糖酵解的终产物为酸性物质-乳酸。肿瘤细胞代谢旺盛,因此会产生大量的乳酸,为了维持细胞内正常的pH,肿瘤细胞膜上的Na+/H+交换器和质子泵等不断的将细胞内的H+运输至细胞外,同时,由于肿瘤周围局部组织灌注较差,酸性物质无法被及时清除,造成酸性物质的累积,最终导致肿瘤细胞外酸性微环境。目前测得的人类肿瘤微环境的pH值集中于5.5-7.0。细胞外酸性环境对于大多数正常细胞来说是有害的,甚至是致死性的,但是肿瘤细胞却可以在这样的环境中存活。肿瘤细胞在酸性环境中存活的具体机制虽然尚未明确,但是研究者已经就酸性微环境对肿瘤细胞的影响进行了研究。一方面,肿瘤酸性微环境可以促进肿瘤的发生发展。早在上世纪90年代,就有研究者发现,细胞外酸性微环境可以诱发细胞突变。后来陆续有研究发现,酸性培养基处理可以造成肿瘤细胞侵袭和转移的增强,乳酸的大量产生可以帮助肿瘤细胞发生免疫逃逸等。另一方面,肿瘤细胞周围酸性微环境也会造成肿瘤细胞周期停滞,抑制肿瘤细胞增殖,诱导压力反应及凋亡,从而对肿瘤产生抑制作用。这些发现表明,酸性微环境会对肿瘤细胞产生广泛而复杂的影响。所有的活细胞都受到氧化压力的影响。活性氧(reactive oxygen species, ROS)是氧化压力最重要的来源,它可以被广义的定义为含有氧原子的活性分子。ROS在癌症中的作用是多重性的。低中水平的ROS可以促进细胞增殖、诱发突变,从而促进肿瘤的发生。而高水平ROS可以导致严重的细胞损伤,甚至造成细胞死亡。肿瘤细胞增殖速度快,因此对ATP的需求量很大。肿瘤细胞在产生能量的同时,也积累了大量ROS,肿瘤细胞需要清除ROS,才能存活下去。因此,肿瘤细胞被认为需要具有很高的抗氧化能力来调节ROS水平,以保护细胞免受氧化损伤。之前的研究者已经发现短期酸性条件处理后,肿瘤细胞ROS水平增高,而长期酸性条件下肿瘤细胞ROS水平情况尚无报道。自噬是细胞对自身受损细胞器和变性蛋白质等成分进行降解并重新利用的过程,该过程高度保守,对于细胞命运起着重要的作用。自噬参与维持细胞稳态,正常细胞中也可以检测到低水平的自噬。当受到压力或者刺激(例如乏氧、饥饿、感染、电离辐射等)时,自噬可以通过对细胞内物质的重新利用帮助细胞生存,但是过高或者过低水平的自噬会导致细胞走向死亡。自噬与ROS存在互相作用。一方面,高水平的ROS可以诱发自噬,另一方面,自噬也可以对ROS水平产生影响。已经有研究者发现,长期酸性条件处理的乳腺癌细胞中自噬水平增高,且该细胞的生存依赖于自噬。以上发现均表明,酸性微环境对肿瘤细胞有着重要的影响。前人所做研究绝大多数是对肿瘤细胞进行数小时到数天不等的短期酸性条件处理,而实际上,肿瘤细胞在体内是长期处于酸性微环境中的。那么长期酸性条件会使肿瘤细胞会受到怎样的影响呢?针对该问题,我们以人结肠癌细胞系为对象进行了研究,并得到以下三部分结果：第一部分适应酸性微环境的结肠癌细胞的细胞学特征为了了解长期酸性条件对结肠癌细胞的影响,我们用酸性培养基(pH 6.5)对人结肠癌细胞系(HCT15、HCT116、LoVo和SW480,均为结肠腺癌细胞)进行不少于三个月的处理,期间适时进行细胞传代。HCT15、HCT116和LoVo细胞可以得到适应酸性微环境的细胞(即extended/6.5细胞,记作-ext细胞),而SW480细胞无法耐受三个月的酸性条件处理。为了明确长期酸性培养基处理对结肠癌细胞形态学方面的影响,我们用显微镜观察经酸性培养基短期及长期处理的HCT15、HCT116和SW480细胞。我们发现,经过酸性培养基处理3天的HCT15和HCT116细胞的形态已经发生变化：细胞变得纤长,细胞密度降低,且这种现象在HCT15-ext和HCT116-ext细胞中表现更为明显。但是SW480细胞的形态变化不明显。由于酸性条件处理下HCT15和HCT116细胞的形态学改变与发生EMT的细胞非常相似,我们通过实时荧光定量PCR以及Western Blotting的方法对EMT相关基因进行了检测。结果发现,相比于HCT15细胞,HCT15-ext细胞的上皮细胞标记物在转录以及蛋白水平上表达下调,而间质细胞标记物表达上调。这些结果说明适应了酸性微环境的结肠癌细胞发生了EMT。接下来我们对适应了酸性微环境的结肠癌细胞的增殖、细胞周期分布及凋亡情况进行检测。我们用EdU掺入的方法对短期及长期酸性培养基处理后HCT15和HCT116细胞的增殖率进行检测,发现经过3天和3个月以上酸性培养基处理的HCT15细胞的增殖率均低于对照组细胞。HCT116细胞也得到类似结果。说明酸性微环境可以抑制结肠癌细胞的增殖。接下来,我们用流式细胞术的方法对HCT15细胞、经酸性培养基短期处理的HCT15细胞以及HCT15-ext细胞的细胞周期分布情况进行检测,结果发现,经酸性培养基进行短期处理的HCT15细胞即发生G1期的阻滞,且HCT15-ext细胞仍保持了G1期阻滞的特点。HCT116细胞和LoVo细胞的细胞周期检测也得到相似结果。用Annex V和PI双染的方法检测结肠癌细胞凋亡情况,结果发现,HCT15-ext细胞的凋亡比例低于HCT15细胞,HCT116-ext细胞也是如此。另外,Western Blotting检测BAX和BCL-2的表达水平也支持该结论。以上结果说明适应了酸性微环境的结肠癌细胞增殖率下降,呈现G1期停滞并且凋亡受到抑制。综上所述,适应了酸性微环境的结肠癌细胞的细胞学特征发生了一系列改变,表现在间质化显现、增殖减缓、G1期停滞以及凋亡水平降低。第二部分GSH在结肠癌细胞适应酸性微环境过程中的作用之前已经有研究者发现,短期的酸性培养基处理会使细胞的ROS水平增高。为明确经酸性培养基长期处理的结肠癌细胞的ROS水平,我们用流式细胞术对HCT15细胞、酸性培养基处理4h的HCT15细胞以及HCT15-ext细胞的ROS水平进行检测,发现酸性培养基处理4h的HCT15细胞的ROS水平高于对照细胞,而HCT15-ext细胞的ROS水平低于对照细胞。HCT116细胞和LoVo细胞的ROS水平也表现出同样的趋势。该结果说明适应了酸性环境的结肠癌细胞的ROS水平普遍低于对照细胞,这是一种有趣的现象。还原型谷胱甘肽(GSH)是细胞内最重要的抗氧化物,可能参与维持适应酸性微环境的结肠癌细胞的低水平ROS。为了明确这一点,我们用实时荧光定量PCR、Western Blotting和流式细胞术的方法对GSH相关的基因进行检测。结果显示,相比于HCT15细胞,HCT15-ext细胞中帮助产生和维持GSH的基因在转录以及蛋白水平上表达上调,而参与GSH降解的基因下调。另外,GSR、 CD44以及GPXs本身具有抗氧化性。HCT116和HCT116-ext细胞中也得到了相似的结果。接下来,我们使用GSH和GSSG检测试剂盒对GSH的含量进行测定,结果显示HCT15-ext细胞中GSH含量以及GSH/GSSG比率均明显高于对照细胞。这提示我们,在适应了酸性微环境的结肠癌细胞中,GSH可能参与维持低水平ROS。为了证明GSH对适应了酸性微环境的结肠癌细胞的生存以及ROS水平的影响,我们用马来酸二乙酯(DEM,一种GSH耗竭剂)、丁硫氨酸亚砜胺(BSO,一种GCL抑制剂)以及GSR siRNA对HCT15细胞和HCT15-ext细胞进行处理,通过MTT和平板克隆形成实验来评价GSH水平对这两种细胞生存的影响,并用流式细胞术的方法检测ROS水平的变化。实验结果显示,相比于对照组细胞,HCT15-ext细胞对DEM、BSO和GSR siRNA的敏感度更高,且经BSO和GSR siRNA处理的结肠癌细胞的ROS水平高于对照处理组。HCT116和HCT116-ext细胞也得到相似结果。以上结果说明,适应酸性微环境的结肠癌细胞中ROS水平降低,以GSH为中心的抗氧化物帮助维持ROS低水平,且GSH对长期酸性条件下结肠癌细胞的生存起到重要的作用。第三部分自噬在结肠癌细胞适应酸性微环境过程中的作用有研究者报道称,用酸性培养基对人乳腺癌细胞MDA-MB-231进行3个月的处理后,该细胞的自噬水平增高,且自噬是该细胞在慢性酸性微环境中的生存所依赖的。为明确结肠癌细胞在长期酸性环境下的生存是否也依赖自噬,我们用实时荧光定量PCR和Western Blotting的方法对自噬相关基因进行检测,发现相比于HCT15细胞,HCT15-ext细胞中自噬相关基因在转录以及蛋白水平上的表达均提示自噬水平的增高。另外,用透射电镜对HCT15和HCT15-ext进行观察,可以看到HCT15-ext的自噬水平明显高于HCT15细胞。HCT116和HCT116-ext细胞也得到类似结果。LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ的比例增高以及电镜下观察到双层膜结构的自噬体都是自噬发生的标志。因此,我们可以得出结论,适应酸性微环境的结肠癌细胞的自噬水平高于对照细胞。接下来,为了明晰自噬对于适应了酸性微环境的结肠癌细胞的重要性,我们用自噬抑制剂6-氨基-3-甲基嘌呤(3-MA)以及ATG5 siRNA对HCT15和HCT15-ext细胞进行处理后,检测细胞凋亡情况。结果发现,自噬被抑制后HCT15-ext细胞凋亡水平有明显的增高,而HCT15细胞变化不大。相似的结果在HCT116和HCT116-ext细胞中也有发现。这些结果都说明,适应了酸性微环境的结肠癌细胞的生存依赖于自噬。目前研究认为,自噬和ROS之间可以相互影响。由于适应了酸性微环境的结肠癌细胞中自噬水平增高,为了明确自噬对于酸性微环境中长期存活的结肠癌细胞中ROS水平的降低是否起作用,我们用3-MA以及ATG5 siRNA对HCT15细胞和HCT15-ext细胞进行处理,然后检测它们的ROS水平。结果发现经过3-MA和ATG5 siRNA处理后,HCT15-ext细胞和HCT15细胞的ROS水平均降低,且HCT116和HCT116-ext细胞也得到类似结果。以上结果说明,在适应了酸性微环境的结肠癌细胞中,自噬并未参与维持低水平ROS。该部分结果说明,适应酸性微环境的结肠癌细胞中自噬水平增高,且自噬对于这种细胞的生存非常重要,但是自噬对适应酸性微环境的结肠癌细胞中ROS的低水平并无贡献。
[Abstract]:Cancer is becoming the first killer of human beings . The World Health Organization ( WHO ) released the World Cancer Report , 2014 . In 2012 , there was a significant increase in the incidence of cancer - related deaths ( 14 million ) and cancer - related deaths ( 8.2 million ) . In China , there were 69.4 million people dead in colorectal cancer . In order to maintain normal pH in tumor cells , the acidic microenvironment can induce cell mutation . HCT15 , HCT116 , LoVo and SW480 cells were treated with acidic medium ( pH 6.5 ) . The results showed that the expression of HCT15 , HCT116 , LoVo and SW480 cells in human colon cancer cells could not tolerate three months . The results showed that the levels of ROS in HCT15 - ext cells were higher than that of control cells . It was found that the autophagy levels of HCT15 - ext cells and HCT15 - ext cells were significantly higher than those in HCT15 cells and HCT15 - ext cells .

【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.35
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本文编号：1829581