DNA损伤修复相关蛋白介导的肺泡上皮EMT在放射性肺纤维化中的作用及机制研究
本文选题：电离辐射 + 放射性肺纤维化 ； 参考：《石河子大学》2017年硕士论文
【摘要】：目的:通过实验探究DNA损伤修复相关蛋白DNA-PKcs介导辐射诱导的EMT发生。进一步阐明DNA损伤修复蛋白DNA-PKcs介导辐射诱导的EMT作用及机制。从而为DNA-PKcs在辐射诱导的肺纤维化方面的生物学功能提供基础依据。方法:采用6°Coγ射线照射A549细胞,利用Western blot、免疫荧光、流式细胞术在不同剂量不同时间下检测上皮标志物与间质标志物的变化,建立辐射诱导的上皮间质转化模型。采用Western blot、免疫荧光、流式细胞术检测敲低DNA-PKcs蛋白后对辐射诱导的EMT的作用,探究DNA-PKcs是否介导了电离辐射诱导的EMT的发生。采用Western blot实验检测敲低DNA-PKcs蛋白后对辐射诱导的EMT的上游转录因子的变化,推测DNA-PKcs介导辐射诱导的的EMT的具体作用机制。同时检测在DNA-PKcs敲低细胞系中敲低twi st是否能逆转DNA-PKcs敲低对辐射诱导的EMT的影响,以判断DNA-PKcs是否通过twist来影响EMT。以及检测DNA-PKcs敲低后twist表达的变化及twist蛋白降解速率,探究DNA-PKcs对twist稳定性的调节。采用免疫共沉淀实验检测DNA-PKcs与twist之间是否存在相互作用。从而推测DNA-PKcs介导辐射诱导的EMT的可能机制。结果:1.Western blot结果显示60Coγ射线照射A549细胞后,随着照射时间和照射剂量的增加,上皮标志物含量逐渐减少,间质标志物逐渐增多,在6Gy,48h最为明显,此结果和免疫荧光、流式细胞术结果共同说明了辐射能够诱导肺上皮细胞发生EMT。2.Western blot、免疫荧光、流式细胞术.结果显示,DNA-PKcs敲低后相对于对照组,进一步促进了辐射诱导的EMT。3.采用Western blot结果显示,在DNA-PKcs敲低细胞系中敲低twist后能够逆转因DNA-PKcs敲低而促进的辐射诱导的EMT,说明DNA-PKcs是通过twist作用来影响EMT。4.免疫共沉淀结果显示DNA-PKcs与twist具有的相互作用。5.Western blot结果显示,DNA-PKcs敲低后,twist蛋白表达上调并且降解速率变慢,说明DNA-PKcs可调节twist的稳定性。结论:1.电离辐射能够诱导肺上皮细胞发生EMT。2.DNA-PKcs介导了辐射诱导的EMT的发生。。3.DNA-PKcs可能是通过调控twist的降解来调节辐射诱导的EMT。
[Abstract]:Objective: To explore the effect of DNA damage repair related protein DNA-PKcs mediated radiation induced EMT. Further elucidate the effect and mechanism of DNA damage repair protein DNA-PKcs mediated EMT induced radiation, thus providing basic basis for the biological function of DNA-PKcs in radiation induced pulmonary fibrosis. Method: 6 degree Co gamma ray irradiation of A5 49 cells, using Western blot, immunofluorescence and flow cytometry to detect the changes of epithelial markers and interstitial markers at different doses at different doses and establish a radiation-induced epithelial mesenchymal transition model. The effects of Western blot, immunofluorescence and flow cytometry on the radiation induced EMT after detection of low DNA-PKcs protein were detected, and DNA-P was explored. Whether Kcs mediates the occurrence of EMT induced by ionizing radiation. Using the Western blot test to detect the changes in the upstream transcriptional factor of radiation induced EMT after the knockout of the low DNA-PKcs protein, we speculate on the specific mechanism of the DNA-PKcs mediated radiation induced EMT. At the same time, whether the low twi st in the DNA-PKcs knockout cell line can reverse the DNA-PKcs knockout. The effect of low on radiation induced EMT is to determine whether DNA-PKcs affects EMT. through twist and the change of twist expression after DNA-PKcs knockout and the degradation rate of twist protein. The regulation of DNA-PKcs to twist stability is explored. The interaction between DNA-PKcs and twist is detected by the immunoprecipitation experiment. The possible mechanism of mediating radiation induced EMT. Results: the results of 1.Western blot showed that after 60Co gamma rays irradiated A549 cells, the content of epithelial markers decreased gradually with the increase of irradiation time and irradiation dose, and the interstitial markers increased gradually, in 6Gy, the most obvious in 48h. The results of this fruit and immunofluorescence and flow cytometry demonstrated the convergence. Radiation induced EMT.2.Western blot, immunofluorescence and flow cytometry in the lung epithelial cells. The results showed that after the DNA-PKcs knockout, the radiation induced EMT.3. was further promoted by Western blot results, and the radiation induced by the low twist knockout in the DNA-PKcs knockout cell line could reverse the radiation induced by the DNA-PKcs knockout. The EMT, indicating that DNA-PKcs affects the EMT.4. immunoprecipitation results through the twist effect, shows the interaction of DNA-PKcs and twist with the interaction.5.Western blot, which shows that the expression of twist protein is up and the degradation rate slows after DNA-PKcs knock down, indicating that DNA-PKcs can regulate the stability of twist. Conclusion: 1. ionizing radiation can induce lung epithelium. EMT.2.DNA-PKcs mediated the generation of radiation-induced EMT...3.DNA-PKcs may regulate radiation-induced EMT. by regulating the degradation of twist.
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R730.55
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，本文编号：1872067
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