ERCC1、TS和TUBB3的表达与胃癌化疗敏感性及其预后的相关性研究

发布时间：2018-05-11 18:22

本文选题：胃癌 + 化学治疗　；参考：《南方医科大学》2016年博士论文

【摘要】：一、研究背景及目的胃癌是人类最常见的恶性肿瘤之一,发病率位于全球最常见的恶性肿瘤中的第4位,肿瘤相关死亡原因居第2位。中国是胃癌高发国家,其发病人数占全世界的42%,并且新发胃癌患者愈来愈年轻化,其死亡率仅次于肺癌和肝癌。世界上大多数国家包括中国尚未开展胃癌常规性筛查,同时胃癌起病隐匿,早期常常无典型症状体征,多数病例常在晚期才会被确诊,单纯手术治疗疗效差,术后5年生存率仅20%左右,严重危害人们的生命与健康。胃癌的发生发展是一个多阶段多因素多步骤共同作用的复杂过程,涉及多个癌基因的活化和抑癌基因的失活,但胃癌发病的分子机制迄今尚未完全明确,目前研究结果显示,幽门螺旋杆菌感染、饮食、吸烟及宿主的遗传易感性是影响胃癌发生的重要因素。目前研究表明,个体间化疗疗效的差异不能用患者年龄、性别、组织类型、生长部位、脏器功能状态等来加以解释。影响化疗疗效及毒性反应的主要因素是药物基因组学。药物基因组学是研究基因变异所致的不同疾病对药物的不同反应,是在药物遗传学基础上发展起来的新兴学科。20世纪50年代,人们就发现不同的遗传基因会导致药物不同的反应。由于胃癌患者对化疗的敏感性不同,使真正获益于化疗患者并不多,如果选择不当,反而使一些对于化疗不敏感的患者延误治疗、增加痛苦及治疗费用。因此,筛选晚期胃癌患者化疗的敏感性生物标记物,对患者的化疗敏感性进行预测,可以有效避免上述风险,使患者最大程度获益。铂类药物对肿瘤的细胞毒性作用主要是通过形成铂-DNA加合物,其作用靶点为DNA。铂-DNA加合物可以引起链间交联诱导DNA畸变,从而抑制DNA修复。导致顺铂耐药的一个重要机制就是核苷酸切除修复(nucleotide excision repair, NER), NER在DNA修复中发挥着重要作用,其修复过程是一个复杂的过程。切除修复交叉互补基因1(excision repair cross-complementing gene 1, ERCC1)是NRE通路中1个关键基因,ERCC1的表达水平与铂类耐药有关。氟尿嘧啶类药物是临床上重要的抗肿瘤药物,其抗肿瘤作用主要源于其竞争性抑制胸苷酸合成酶(thymidylate synthase, TS), TS是嘧啶核苷酸合成通路的限速酶,在DNA的合成和修复当中起着极为重要的作用,为氟尿嘧啶类药物(如5-氟尿嘧啶、卡培他滨、S-1)的靶点,因此TS被认为是5-氟尿嘧啶(5-FU)及其衍生物治疗恶性肿瘤过程中的一个靶点,其活性高低的变化与肿瘤对5-FU耐药密切相关。TS是5-dUMP磷酸化成5-dTMP的一个限速酶,正常情况下,在常规合成中5-dTMP转变成合成DNA的5-dTTP,缺乏TS存在,DNA合成受限,最终导致细胞死亡。增加肿瘤细胞中TS的表达能阻断5-FU诱导的细胞核毒性,促进DNA合成,修复肿瘤细胞。微管蛋白结合类药物是作用于细胞微管,通过影响纺锤体形成,从而抑制细胞有丝分裂的一类广谱化疗药,常用于实体瘤和血液恶性肿瘤。紫杉醇和多西紫杉醇是临床上常用的抗微管蛋白化疗药物,该类药物可以促进微管聚合和稳定已聚合微管,也称为微管稳定剂。在接触该类药物后,细胞内会积累大量微管,从而干扰细胞的代谢,特别是使细胞有丝分裂停止,发挥抗肿瘤效果。细胞内微管蛋白分α、β两个亚型,是有丝分裂时纺锤体的基本组成单位,也是抗微管药物的主要作用靶点。β-微管蛋白Ⅲ(class Ⅲ β-tubulin, TUBB3)是微管蛋白家族中的一种亚型,多个临床研究表明,在肺癌、卵巢、前列腺、乳腺及胰腺癌多种人类肿瘤细胞株中,TUBB3高表达与紫杉醇类化疗药物耐药有关。2012年美国国家癌症综合癌症网络(NCCN)非小细胞肺癌的指南中已经明确指出,在接受化疗前检测ERCC1、RRM1表达水平检测可提高有效率和患者生存率,但在胃癌等其它肿瘤中尚未提及。然而近2年公布的研究大多提示在肺癌中ERCC1不能预测含铂化疗疗效试验,这提示化疗分子标记物的检测及其指导化疗的临床研究存在很大争议,化疗相关的分子标志物在临床研究中依然是巨大挑战。目前国内外专家对生物标记物是否可预测晚期胃癌预后及化疗疗效相关的研究相对较少,且目前研究多处于回顾性研究。我们课题组在临床上收集胃癌病例,观察胃癌组织中ERCC1、TS和TUBB3的表达水平与临床病理特征的相关性,分析它们与化疗敏感性及预后相关性,并通过体外细胞实验加以证实,为胃癌个体化治疗的靶标检测提供临床及实验理论依据,规范临床治疗,高效使用医疗资源为病人服务具有重要意义。二、实验方法第1章ERCC1、TS和TUBB3在胃癌组织中的表达及相关性研究1、收集湖南省邵阳市中心医院2008年12月至2011年12月临床资料完整的118例胃癌患者,其中2例患者因免疫组化染色不符合要求而被剔除,共116例完成全部试验可供评价,按美国癌症联合委员会(AJCC)胃癌TNM分期,Ⅱ期23例,Ⅲ期66例,Ⅳ期27例,男62例,女54例,组织学分级：高分化20例,中分化35例,低分化61例,有淋巴结转移69例,未发生转移47例。收集资料包括病人的年龄、性别、住院号、病理类型,ECOG评分、有无淋巴结转移、肿瘤大小和临床分期。所有胃癌组织标本经10%福尔马林固定,常规脱水、石蜡包埋,一部分标本用于免疫组化检测胃癌组织中ERCC1、TS和TUBB3蛋白的表达水平；另一部分标本用于分支液相芯片技术检测胃癌组织中ERCC1TS和TUBB3 mRNA的表达水平。分析ERCC1、TS和TUBB3在胃癌中的表达与临床病理特征之间的关系,同时分析ERCC1、TS和TUBB3三者的相关性。2、免疫组化结果判读胃癌组织标本用10%福尔马林固定、石蜡包埋、组织切片(4gm),采用免疫组化SP法检测ERCC1、TS和TUBB3蛋白,操作按免疫组化试剂盒说明书进行。用PBS代替一抗作阴性对照,用已知阳性切片作阳性对照。由2位病理科高级职称医师在对临床资料不知情的情况下,对标本染色结果进行判断。所有评分分为0、1、2、3和4分,2分定义为高表达,≤2分为低表达。第2章晚期胃癌中ERCC1、TS和TUBB3表达与化疗疗效及预后的研究1、选择湖南省邵阳市中心医院2008年12月至2011年12月临床及随访资料完整并经病理学确诊的晚期胃癌患者67例进行回顾性分析(包括失去手术指征的晚期胃癌及术后复发转移的胃癌患者)。免疫组化方法检测胃癌组织中ERCC1、TS和TUBB3蛋白的表达水平,分析ERCC1与铂类、TS与氟尿嘧啶类及TUBB3与紫杉醇类化疗药物敏感性及预后的相关性。2、化疗方案及临床疗效评价接受卡培他滨、替吉奥胶囊或5-氟尿嘧啶为基础的化疗组,具体用法为：根据体表面积计算剂量,卡培他滨1000-1250mg/m2,替吉奥胶囊40mg/m2,饭后半小时口服,每天2次,连用2周,休息1周,每3周重复,5-FU 1000mg/m2,持续泵入,d1-3,每3周重复。接受紫杉醇或多西紫杉醇为基础的化疗组,具体用法为：多西紫杉醇75mg/m2,静脉滴注d1或紫杉醇150-175 mg/m2,静脉滴注,dl,每3周重复。接受顺铂或奥沙利铂为基础的化疗组,具体用法为：顺铂75mg/m2,静脉滴注dl或奥沙利铂130 mg/m2,静脉滴注,d1,每3周重复。其中DCF方案36例,TP方案11例,多西他赛单药方案2例,XELOX方案8例,替吉奥胶囊单药方案2例,希罗达单药方案3例,ECF方案5例,对于年龄超过70岁、PS评分为2分或一般情况较差的患者化疗药物的剂量稍微减量,对能够耐受的患者给予4-6个周期化疗,未完成2周期化疗或失访的患者作为脱落病例,至少2个周期化疗后纳入疗效评价。每个患者治疗2周期后,重新复查胸部+全腹部+盆腔增强CT、胃镜。参照RECIST 1.1实体瘤评价疗效标准进行疗效评价,分为完全缓解(complete response, CR)、部分缓解(partialresponse, PR)、稳定(stable disease, SD)和进展(progression disease, PD),定义如下：完全缓解(CR)定义为临床症状完全消失并且CT检查病灶完全消失；部分缓解(PR)定义为CT检查所有的肿瘤病灶最长径及其垂直径乘积缩小50%以上,并且没有新的病灶出现；病情稳定(SD)定义为所有的肿瘤病灶最长径及其垂直径乘积缩小不超过50%,增加不超过25%；疾病进展(PD)定义为所有的肿瘤病灶最长径及其垂直径乘积增大超过25%以上或者出现新的病灶。所有患者评估时间一致,如出现CR、PR和SD为临床受益,继续同方案化疗2至4个周期,最多为6个周期,如出现PD,则更改治疗方案。总生存期(OS)定义为从实验入组开始至因任何原因引起死亡的时间。无进展生存期(PFS)定义为从实验入组开始至疾病进展的时间,采用门诊随访、电话随访等方式,末次随访时间为2014年12月。第3章胃癌组织中ERCC1、TS和TUBB3与化疗药物体外药敏实验选择湖南省邵阳市中心医院及南方医科大学南方医院2013年10月至2014年9月期间外科手术的胃癌患者的新鲜标本48例,年龄49-67岁,中位年龄57岁,男28例,女性20例,Ⅱ期18例,Ⅲ期28例,Ⅳ期2例,组织学分级：高分化8例,中分化10例,低分化30例,有淋巴结转移27例,未发生转移21例,所有入选病人在术前未接受放化疗及其它抗肿瘤治疗。术后收集新鲜胃癌组织标本,每份癌组织标本均分成两份：一份立即装入含有100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的RPM11640的离心管中,用于原代培养细胞,制成单细胞悬液,立即送于用ATP-TCA法检测其对体外化疗药物的敏感性。另一部分将组织固定,石蜡包埋用于免疫组化检测ERCC1、TS和TUBB3蛋白的表达。分析体外胃癌细胞中ERCC1与顺铂、TS与5-氟尿嘧啶及TUBB3与紫杉醇化疗药物敏感性的相关性。三、实验结果第1章1、在116例胃癌病理标本中,ERCC1、TS和TUBB3蛋白在高、中、低不同分化程度的胃癌组织中均有不同程度的表达,ERCC1蛋白阳性表达主要位于肿瘤组织的胞浆和胞核,为棕褐色颗粒,ERCC1低表达组占50.86%(59/116),ERCC1高表达组占49.14%(57/116)。TS蛋白阳性反应颗粒主要位于肿瘤组织的胞浆和胞核,为棕黄色颗粒,TS低表达组占48.28%(56/116),TS高表达组占51.72%(60/116)。在肿瘤组织中TUBB3主要定位于细胞核,成棕黄色弥漫性细颗粒状分布,TUBB3低表达组占55.17%(64/116),TUBB3高表达组占44.83%(52/116)。2、116例胃癌组织标本中,免疫组化及分支液相芯片技术两种方法检测结果提示ERCC1、TS和TUBB3表达与患者性别、年龄、ECOG评分、组织学分化程度、临床分期、淋巴结转移均无明显相关性(P0.05)。在116例胃癌组织标本中,免疫组化检测ERCC1、TS和TUBB3蛋白三者共同高表达占18.10%(21/116), ERCC1、TS和TUBB3蛋白三者共同低表达占12.93%(15/116)。ERCC1、TS蛋白两者共同高表达为31.03%(36/116),两者同时低表达的患者为25.00%(29/116),两种蛋白在胃癌组织中的表达不存在相关性(χ2=1.381,P=0.240)。ERCC1、TUBB3蛋白共同高表达为26.72%(31/116),两者同时低表达的患者为19.83%(23/116),两种蛋白在胃癌组织中的表达亦不存在关联性(χ2=0.348, P=0.556)。TS和TUBB3蛋白共同高表达37.07%(43/116),两者同时低表达的患者为25.86%(30/116),两种蛋白在胃癌组织中的表达存在统计学相关性(χ2=5.690,P=0.017)。第2章1、67例晚期胃癌中,其中有60例患者接受含奥沙利铂或顺铂为基础的化疗方案,1例患者因免疫组化质量问题和2例患者因石蜡标本太少被剔除,57例患者中化疗疗效达CR 2例,PR 26例,SD 17例,PD 12例,化疗总有效率(CR+PR)为49.12%(28/57),ERCC1低表达组有效率为66.67%(20/30),ERCC1高表达组有效率为29.63%(8/27),两者差异具有统计学意义(χ2=7.8,P=0.005)。其中有53例患者接受含卡培他滨、替吉奥胶囊或5-氟尿嘧啶基础的化疗方案,有1例患者因石蜡组织标本太少被剔除,化疗疗效达CR 1例,PR 20例,SD 18例,PD 13例,化疗总有效率(CR+PR)为40.38%(21/52),TS低表达组有效率为63.46%(16/27),TS高表达组有效率为36.54%(5/25),两者差异具有统计学意义(χ2=8.310,P=0.004)。其中有49例患者接受含多西他赛或紫杉醇为基础的化疗方案,有3例患者因组织标本太少被剔除,化疗疗效达CR 1例,PR 17例,SD 22例,PD 6例,化疗总有效率(CR+PR)为39.13%(18/46), TUBB3低表达组有效率为54.17%(13/24),TUBB3高表达组有效率为22.73%(5/22),两者差异具有统计学意义(χ2=4.736,P=0.029)。2、ERCC1低表达组患者的中位PFS和OS分别为6.0个月和12.9个月,ERCC1高表达组患者的中位PFS和OS分别为3.1个月和7.8个月,ERCC1低表达组较高表达组的PFS和OS均延长,差异有统计学意义(PFS:P=0.005, OS:P=0.002)。TS低表达组患者的中位PFS和OS分别为7.8个月和13.3个月,TS高表达组患者的中位PFS和OS分别为3.1个月和8.3个月,TS低表达组较高表达组的PFS和OS均延长,差异有统计学意义(PFS:P=0.007,OS:P=0.003)。 TUBB3低表达组患者的中位PFS和OS分别为5.9个月和11.6个月,TUBB3高表达组患者的中位PFS和OS分别为3.9个月和7.9个月,TUBB3低表达组较高表达组的PFS和OS均延长,差异有统计学意义(PFS:P=0.032,OS:P=0.001)。3、单因素及多因素分析得出,ERCC1、TS及TUBB3均为晚期胃癌的预后因素。第3章1、48例胃癌组织体外药敏的检测中,有3例标本在原代细胞培养过程中因细菌污染、操作等原因导致传代失败,余下45例标本进行有效的体外药物实验,并得到有效的实验数据,根据IC90和IC50大小来判断其体外药敏情况。根据判断标准得出,顺铂体外敏感(SS+IS)24例(53.33%),体外耐药(MS+R)21例(46.67%),5-氟尿嘧啶体外敏感(SS+IS)23例(51.11%),体外耐药(MS+R)22例(48.89%),紫杉醇体外敏感(SS+IS)21例(46.67%),体外耐药(MS+R)24例(53.33%),与临床药物疗效基本一致。2、45例胃癌组织中,ERCC1高表达为21例(46.67%),低表达24例(53.33%)。21例ERCC1高表达组敏感例数7例(33.33%),24例低表达组敏感例数17例(70.83%), ERCC1低表达者对顺铂的敏感有效率要明显高于ERCC1高表达者,且差异在统计学上有显著性意义(P0.05)。TS高表达为19例(42.22%),低表达26例(57.78%)。19例TS高表达组敏感例数5例(26.32%),26例低表达组敏感例数18例(69.23%),TS高表达者对5-氟尿嘧啶的敏感有效率要明显低于低表达者,且差异在统计学上有显著性意义(P0.01)。TUBB3高表达为22例(48.89%),低表达23例(51.11%)。22例TUBB3高表达组敏感例数5例(22.73%),23例低表达组敏感例数16例(69.57%),TUBB3高表达者对紫杉醇的敏感有效率要明显低于低表达者,且差异在统计学上有显著性意义(P0.01)。四、结论1、ERCC1、TS和TUBB3在胃癌组织中均有不同程度表达,三者与临床特征均无相关性,TS和TUBB3蛋白之间存在一定的相关性。2、晚期胃癌组织中ERCC1、TS和TUBB3的表达与化疗药物耐药及预后具有一定的相关性,低表达组的化疗疗效及生存预后好于高表达组。3、体外实验证实ERCC1、TS和TUBB3的表达与化疗药物耐药具有一定的相关性,低表达组的耐药发生率低于高表达组。4. ERCC1、TS和TUBB3有望成为判断胃癌患者化疗疗效及预后的分子标志物。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.2

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