IgD在B细胞非霍奇金淋巴瘤中的表达及对其细胞的促增殖作用和部分机制

发布时间：2018-05-17 15:54

  本文选题：B细胞非霍奇金淋巴瘤 + 弥漫大B细胞淋巴瘤　； 参考：《安徽医科大学》2016年博士论文

【摘要】：非霍奇金淋巴瘤(NHL)按细胞来源分为B细胞淋巴瘤和T细胞/NK细胞淋巴瘤。B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)是一种定向于B细胞系的淋巴细胞肿瘤,在全世界,85%以上的NHL是成熟B-NHL。 B-NHL分为若干个亚型,包括弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和伯基特淋巴瘤(BL). DLBCL是最常见的B-NHL,占成人NHL的30%-40%,在儿童NHL中的比例不足5%。BL好发于儿童和青少年,占所有NHL的3%-5%,占儿童NHL的40%。DLBCL和BL都属于侵袭性B-NHL,在免疫缺陷患者中发病率均显著增高。联合化疗,是DLBCL和BL患者目前最有效的治疗方案。但是,仍有部分患者难以耐受很多免疫化学疗法的毒性,或因肿瘤进展而死亡,因此寻找更加新颖的治疗方法,发现新的治疗靶点仍然是目前工作的重点。免疫球蛋白D(IgD)分为分泌型IgD和膜结合型IgD,在抗原识别、B淋巴细胞分化和激活以及免疫反应调节上发挥重要作用。IgD还与B淋巴细胞的外周清除有关,干扰免疫耐受的诱导。IgD受体(IgDR)与IgD结合可以介导B细胞自身反应、T和B细胞活化及相互作用。IgD及IgDR有可能成为B细胞恶性增殖相关疾病的新的治疗靶点,阻断IgD-IgDR之间的相互作用可能成为B-NHL免疫疗法新目标。本课题先从临床入手,选取初诊DLBCL患者淋巴结病理组织标本及外周血样本,运用免疫组化(IHC)、流式细胞术(FCM)、酶联免疫吸附实验(ELISA)等方法检测IgD及IgDR在DLBCL患者体内的表达。并结合体外实验观察外源性人IgD (hIgD)蛋白对Daudi、MEC-2和REC-1三种B-NHL细胞的促增殖作用,以Daudi细胞为研究对象,研究hIgD对其促增殖作用的部分机制,探讨IgD及IgDR在B-NHL发病中所起的作用以及为其成为新靶点的可能性提供实验依据。目的：选取DLBCL患者淋巴结病理组织标本及外周血样本,观察IgD及IgDR的表达,并分析其与DLBCL临床病理参数的关系。结合体外实验观察hIgD对Daudi、MEC-2和REC-1三种B-NHL细胞的促增殖作用,选择Daudi细胞为研究对象,研究hIgD对其促增殖作用的部分机制,探讨IgD及IgDR在淋巴瘤发病中所起的作用以及为其成为新靶点的可能性提供实验依据。方法：为了观察IgD及IgDR在DLBCL患者体内的表达情况,我们临床收集了34例DLBCL患者和14例反应性增生淋巴结病理组织标本,16例初诊DLBCL患者和10例健康志愿者的外周血样本,完善相关临床资料。采用IHC观察IgD和IgDR在淋巴结病理组织标本中的表达情况；ELISA法检测血清中IgD水平；分离外周血单个核细胞(PBMCs), FCM检测IgD和IgDR的表达情况；采用卡方检验(Fisher精确概率法)和Spearman相关性分析法分析IgD和IgDR与临床病理参数之间的关系。为了观察hIgD蛋白对Daudi、MEC-2和REC-1三种B-NHL细胞的促增殖作用,以及hIgD对Daudi细胞促增殖作用的部分机制,我们体外培养Daudi、MEC-2和REC-1细胞,采用CCK-8法检测细胞活力；FCM检测Daudi细胞CD19、IgM、 IgD和IgDR的表达情况、Daudi细胞周期及细胞凋亡率；实时荧光定量PCR (QRT-PCR)法检测Daudi细胞c-myc、cyclin D3、CDK6和p16~(INK4a) mRNA的表达；Western blot法检测Daudi细胞c-myc、cyclinD3、CDK6、p16~(INK4a)、70kD蛋白酪氨酸磷酸化、Lyn和p-Lyn蛋白的表达。结果：1.IgD和IgDR在DLBCL患者体内表达且与临床病理参数具有相关性IHC结果表明：IgD和IgDR在DLBCL患者淋巴结病理组织上表达且定位于肿瘤细胞的细胞膜/浆上。在34例DLBCL患者淋巴结病理组织中IgD的阳性表达率为47.1%(16/34),IgDR的阳性表达率为55.9%(19/34)。与反应性增生的淋巴结病理组织相比,DLBCL患者淋巴结组织中IgD和IgDR表达均上调(P0.05),且IgD与IgDR表达显著相关(r=0.426,P=0.02)。进一步相关性分析发现,IgD的阳性表达与血清β2-微球蛋白(β2-MG)水平相关(r=0.408, P=0.035)o IgDR的阳性表达与血清的LDH水平(r=0.46,P=0.013)及国际淋巴瘤预后指标(IPI)评分(r=0.407,P=0.025)相关。ELISA结果显示：与健康志愿者相比,初发DLBCL患者外周血血清中IgD (26.15±1.7 μg/ml)水平明显升高(P=0.014),并且与血清β2-MG (r=0.574, P=0.02)、LDH水平呈正相关(r=0.558,P=0.024)。流式结果发现DLBCL患者外周血PBMCs的IgD平均荧光强度(MFI)(16.49±2.08 vs.10.44±1.89)和IgDR (13.33±1.83 vs.6.74±1.01) MFI都明显高于健康对照组的水平。以上研究结果提示：DLBCL患者淋巴结病理组织和外周血PBMCs中IgD和IgDR及血清中IgD表达均上调,并且与不良预后因素相关,从临床角度初步发现了IgD与IgDR介导的信号通路可能在DLBCL患者体内处于异常激活的状态,并且可能参与了DLBCL的病变过程。2. hIgD促进Daudi、MEC-2和REC-1细胞增殖,加速Daudi细胞G1/S转换,加快Daudi细胞周期进程体外培养并选取对数生长期的Daudi细胞,用不同浓度的hIgD (0.1,0.3,1, 3, 10μg/ml)刺激不同时间(12,24,48,72 h),同时选取对数生长期的MEC-2和REC-1细胞,用hIgD (3 μg/ml)刺激48 h,观察细胞活力和增殖情况。结果表明：与对照组相比,hIgD明显促进Daudi、MEC-2和REC-1细胞的活力和增殖；Annexin-V/PI流式检测结果显示hIgD (3μg/ml)降低了Daudi细胞的凋亡率;PI流式检测结果显示hIgD作用于Daudi细胞增殖周期的G1期和S期发挥促增殖作用。与对照组相比,hIgD刺激后Daudi GI期细胞比例逐渐降低,S期细胞比例逐渐升高,而G2期细胞比例变化不明显。提示hIgD通过加速GI/S时相转换促进Daudi细胞周期进程。进一步检测Daudi细胞c-myc、cyclin D3、CDK6和p16~(INK4a)因子的mRNA和蛋白表达,Q-PCR和Western结果显示：与对照组相比,hIgD刺激后Daudi细胞c-myc、cyclin D3、CDK6的mRNA和蛋白表达明显升高,而pl6INK4a表达明显降低。以上结果提示：hIgD加速GI/S时相转换,加快细胞周期进程促进Daudi细胞增殖可能与其调控c-myc与cyclin D3-CDKe-p16~(INK4a)表达有关。3. hIgD诱导IgDR的表达,启动酪氮酸磷酸化途径可能是促进Daudi细胞增殖的重要机制FCM检测显示Daudi细胞表面CD19+、IgD-、IgM+、IgDR+,提示Daudi细胞是未成熟的B细胞。hIgD(1,3, 10μg/ml)刺激24 h后,与对照组相比,hIgD明显上调Daudi细胞表面IgDR的表达。收集对数生长期Daudi细胞用hIgD(1,3, 10 μg/ml)刺激24h以后提取蛋白用Western blot法检测。结果显示：与对照组相比,hIgD刺激后Daudi细胞70kD蛋白发生酪氨酸磷酸化,我们推测这个蛋白是IgDR的组成成分,接着进一步检测了下游信号Lyn,发现p-Lyn蛋白表达明显升高,而Lyn蛋白表达没有明显变化。由此我们推测：hIgD与IgDR结合以后促进Daudi细胞增殖可能与激活酪氨酸磷酸化途径有关。结论：1.DLBCL患者淋巴结病理组织中IgD和IgDR表达明显上调,且IgD与IgDR表达显著相关,并且与血清β_2-MG、LDH、IPI评分指标相关。初诊DLBCL患者外周血血清中IgD水平明显升高,并且与血清β2-MG、LDH水平呈正相关。初诊DLBCL患者外周血PBMCs中IgD和IgDR表达上调。提示：IgD与IgDR在DLBCL患者体内处于异常激活的状态,可能参与了DLBCL的病变过程。2. hIgD促进Daudi、MEC-2和REC-1细胞的活力和增殖,减少Daudi细胞凋亡,降低Daudi G1期细胞比例,升高S期细胞比例,升高Daudi细胞c-myc、cyclin D3、CDK6的mRNA和蛋白表达,降低p16~(INK4a)表达。提示：hIgD加速G1/S时相转换,加快细胞周期进程促进Daudi细胞增殖可能与其调控c-myc与cyclin D3-CDK6-p16~(INK4a)表达有关。3. hIgD明显上调Daudi细胞表面IgDR的表达,促进Daudi细胞70kD蛋白发生酪氨酸磷酸化,下游信号p-Lyn蛋白表达明显升高,而Lyn蛋白表达没有明显变化。提示：hIgD与IgDR结合以后促进Daudi细胞增殖可能与激活酪氨酸磷酸化途径有关。
[Abstract]:Non - Hodgkin ' s lymphoma ( NHL ) is divided into B - cell lymphoma and T - cell / NK - cell lymphoma by cell source . B - cell non - Hodgkin ' s lymphoma ( B - NHL ) is a lymphocyte tumor oriented to B - cell line . In the world , more than 85 % of NHL is mature B - NHL . B - NHL is divided into several subtypes , including diffuse large B - cell lymphoma and primary primary lymphoma ( BL ) . The study of IgD and IgD plays an important role in the pathogenesis of B - NHL .
The level of IgD in serum was determined by ELISA .
Peripheral blood mononuclear cells ( PBMCs ) were isolated and the expression of IgD and IgDR was detected by FCM .
In order to observe the effect of hIgD protein on Daudi , MEC - 2 and REC - 1 cells , we cultured Daudi , MEC - 2 and REC - 1 cells in vitro .
FCM was used to detect the expression of CD19 , IgM , IgD and IgDR in Daudi cells , Daudi cell cycle and cell apoptosis rate .
Real - time fluorescence quantitative PCR ( QRT - PCR ) method was used to detect the expression of c - myc , cyclin D3 , CD6and p16 ~ ( INK4a ) mRNA in Daudi cells .
The positive expression of IgD and IgDR was significantly correlated with serum levels of 尾 2 - MG ( r = 0.408 , P = 0 . 025 ) . The results showed that the positive expression of IgD and IgDR was 47.1 % ( 16 / 34 ) , and the positive expression of IgD was 55.9 % ( P = 0 . 025 ) . The levels of IgD and IgDR and IgD in peripheral blood mononuclear cells ( PBMC ) were significantly higher than those in healthy controls .
The results showed that hIgD could promote Daudi cell cycle progression by accelerating GI / S phase transformation . The results suggested that hIgD could promote Daudi cell cycle progression by accelerating GI / S phase transformation . The results showed that the expression of IgD and IgDR in peripheral blood mononuclear cells ( LIgD ) was significantly higher than that of control group . hIgD up - regulate the expression of IgDR on Daudi cell , promote the tyrosine phosphorylation of the 70kD protein of Daudi cell , the expression of downstream signal p - Lyn protein is obviously increased , and the expression of Lyn protein has no obvious change .
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R733.1

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