白血病细胞COX-2、bFGF、TGFβ1及VEGF基因表达与白血病患者血清COX-2、bFGF、TGFβ1及VEGF测

发布时间：2018-05-21 19:49

本文选题：急性白血病 + 环氧合酶-2(COX-2)　；参考：《南方医科大学》2016年博士论文

【摘要】：白血病(leukemia)是造血干/祖细胞出现分化受阻、凋亡障碍和恶性克隆性增生而引起的一组异质性的造血系统恶性肿瘤。目前我国白血病的发病率为3-4/10万,在各种恶性肿瘤凋亡率中,白血病在男性患者位居第六位,女性患者位列第八位,在儿童及35岁以下成人中则居首位。研究发现,与实体肿瘤一样,血液肿瘤的发生、发展与血管新生和信号传导密切相关。目前这一研究已逐渐成为众多学者关注的焦点。在肿瘤形成过程中,异常的血管生成发挥着关键作用。肿瘤生长依赖于血管生成。肿瘤细胞具有诱导血管生成的潜能,这种潜能必需在生长因子的刺激下才能转化为发挥作用的表型。碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)是最强的血管生长因子之一,是一种十分重要的正性调控因子。近年来,研究表明,白血病患者体液中bFGF水平亦较正常对照明显升高,骨髓中有明显的血管新生现象。体内体外的各种实验均证实了bFGF对于血管内皮细胞的促增殖活性。人们发现白血病细胞有bFGF和或bFGFR的异常表达,bFGF可以通过自分泌或旁分泌直接刺激白血病细胞,通过加强酪氨酸激酶信号传导水平促进肿瘤细胞增殖。新生血管持续不断的为肿瘤提供营养和排除代谢产物,在肿瘤的发生、转移及预后方面起着重要作用。在很多恶性血液病中,血管增生是一个重要的病理生理过程,骨髓血管增生与AML、ALL和CML的预后不良有关。近年来,对AML和CML患者骨髓血管增生和血管内皮生长因子(VEGF)水平之间关系的研究中发现,与对照组相比,各类型白血病患者骨髓微血管密度都有显著增高,而且与VEGF有明显的相关性,其中CML患者骨髓微血管密度及VEGF水平增高最为显著。环氧合酶-2(cyclooxygenase2, COX-2)在实体瘤中可以促进肿瘤发生、发展,其在白血病中表达也有所提高,COX-2与白血病中VEGF表达及血管新生有关,需要进一步研究证明。COX-2诱导花生四烯酸合成的主要代谢产物PGE2：同样在肿瘤的血管生成中起作用,诱导血管生长因子如VEGF、bFGF合成。血细胞的增殖、分化、成熟及凋亡受多种具有刺激活性或抑制活性的两大类所谓正性或负性的细胞因子组成的网络的调控。转化生长因子β1 (transforming growth factor β1, TGFβ1)是目前已知的作用最强的血细胞增殖的负调控因子,多种正常血细胞如单核细胞、淋巴细胞、血小板等均能产生TGFβ1,它不仅能刺激成纤维细胞的生长,修复创伤,还能调节造血,抑制肿瘤细胞的增殖。目前大多研究开展的是对COX-2、bFGF、TGF β1及VEGF这四种因子单个或两三个因子进行检测,并探讨其临床意义,但理论创新不足,应用范围有限,而本研究通过检测白血病细胞COX-2、bFGF、TGF β1及VEGF基因表达与白血病患者血清COX-2、bFGF、TGF β1及VEGF水平的变化情况,同时对四种因子之间的相关性予以研究,分析各检测指标在白血病的临床治疗中的指导意义,探讨白血病的发生发展与血管生成的关系。第一部分：COX-2、bFGF、TGFβ1及VEGF在急性白血病的表达及其意义目的检测不同类型急性白血病(AL)患者在不同时间段的COX-2、FGF、TGF β1、VEGF等指标的变化情况,分析各检测指标在AL的诊断、治疗及预后判断中的临床意义。方法以在安康市中心医院就诊的90例AL患者为研究对象,以该院体检中心健康体检者40例为正常对照,采用ELISA方法检测血清COX-2、bFGF、TGFβ1及VEGF的含量,并对AL患者进行治疗前、后两个不同阶段的动态检测；对于AL患者,采用骨髓涂片在显微镜下按常规分类计数200个有核细胞,计算原始加幼稚细胞比例的方法进行诊断。结果1.初诊时,AL组的血清COX-2含量出现显著升高的趋势,与正常对照组相较,差异显著,具有统计学意义(P0.001, t/χ2=6.082).2.初诊时,AL组的血清bFGF含量出现显著升高的趋势,与正常对照组相较,差异显著,具有统计学意义(P0.001,t/χ2=820.000)。3.AL组初诊时血清TGFβ1含量明显减低,与正常对照组比较差异有统计学意义(P0.001,t/χ2=860.000)。4.初诊时,AL组的血清VEGF含量出现显著升高的趋势,与正常对照组相较,差异显著,具有统计学意义(P0.001, t/χ2=4133.000).5.治疗前AML组血清bFGF、COX2、VEGF及TGFβ1水平与ALL组患者比较,差异没有统计学意义(分别为P=0.586,χ2=1077.000;P=0.646, χ2= 2906.500; P=0.986,χ2=1135.500; P= 0.729 χ2=2919.000)。6.患者接受2至3个疗程的治疗后,达到完全缓解(CR)时,患者血清TGFβ1含量逐渐恢复到正常数值,与正常对照组相较,差异无统计学意义(P=0.895,χ2=3774.000)。7.患者接受2至3个疗程的治疗后,达到完全缓解(CR)时,血清bFGF、COX2及VEGF含量出现显著降低的趋势,与正常对照组相较,差异无统计学意义(分别为P=0.806,χ2=3756.000；；P=0.868,χ2= 2173.500;P=0.905,χ2= 2181.000).8.患者接受2至3个疗程的治疗后,达到完全缓解(CR)时,bFGF、COX2、 VEGF及TGFβ1水平与治疗前相较,差异有统计学意义(分别为P0.001,F=61.802;P0.001,F=1342.108;P0.001,F=458.935;P0.001, F=1349.146)。9.AL初诊患者治疗前血清bFGF、COX2及VEGF水平与骨髓始加幼稚细胞数呈正相关(分别为R=0.0.303,P=0.005；R=0.435,P0.001；R=0.293,P=0.006),而TGFβ1水平与骨髓始加幼稚细胞数呈负相关(R=-0.379, P0.001)。10.AL初诊患者治疗前血清bFGF、COX2及VEGF水平与TGFβ1水平比较均呈负相关(分别为R=-0.401,P0.001；R=-0.578,P=0.001；R=-0.388,P0.001)。以上数据均采用SPSS20.0统计分析软件进行统计学分析。结论研究表明,促血管生成因子COX-2、VEGF及bFGF在急性白血病患者血清中含量显著增加,化疗后完全缓解组患者血清COX-2、VEGF及bFGF含量显著下降,而血清TGF β1水平在急性白血病患者血清中含量明显减低,而化疗后完全缓解组患者血清TGFβ1含量显著升高,提示血管生成可能在急性白血病的发生、发展中具有一定作用。因此,动态监测AL患者血清COX-2、bFGF、TGFβ1及VEGF水平,可作为急性白血病病情进展的重要参考指标。第二部分：COX-2、bFGF、TGFβ1及VEGF在慢性粒细胞白血病的表达及其意义目的检测不同分期慢性粒细胞白血病(CML)患者不同发展阶段血清COX-2、bFGF、TGFβ1及VEGF的变化,对它们在CML的诊治和术后干预中的临床意义进行探讨。方法以在安康市中心医院就诊的50例初诊CML患者为研究对象,以该院体检中心健康体检者40例为正常对照,采用ELISA方法检测血清COX-2、bFGF、 TGFβ1及VEGF的含量,并对CML患者进行治疗前、后两个不同阶段的动态检测；对于AL患者,采用骨髓涂片在显微镜下按常规分类计数200个有核细胞,计算原始加幼稚细胞比例的方法进行诊断。结果1.初诊时,CML组各期患者的血清COX-2含量显著升高,与正常对照组比较,差异显著,具有统计学意义(P0.001,t/χ2=34.862)。2.初诊时,CML组各期患者的血清bFGF含量显著升高,与正常对照组比较,差异显著,具有统计学意义差异(P0.001,t/χ2=820.000)。3.CML组各期初诊时血清TGFβ1含量明显减低,与正常对照组比较差异有统计学意义(P0.001,t/χ2=1289.000);4.初诊时,CML组各期患者的血清VEGF含量显著升高,与正常对照组比较,差异显著,具有统计学意义(P0.001,t/χ2=1402.000)。5.治疗前CML组急变期患者血清bFGF、COX2及VEGF水平较慢性期患者增高,而TGF β 1水平减低,差异均有统计学意义(分别为P0.001,t/χ2=-6.974; P0.001,t/χ2=485.000;P0.001,t/χ=465.000; P0.001,t/χ2=55.000));26.治疗前CML组加速期患者血清bFGF、COX2及VEGF水平较慢性期患者增高,差异有统计学意义(P0.05),而TGFβ1水平减低,差异有统计学意义(分别为P0.001,t/χ2=6.117；P0.001,t/χ2=575.000；P0.001,t/χ2= 445.000;P0.001,t/χ2=65.000)。7.经过甲磺酸伊马替尼治疗后,达到完全缓解(包括完全血液学缓解、完全遗传学缓解及完全分子学缓解)(CR)时,血清bFGF、COX2及VEGF含量明显下降,而TGFβ1含量基本恢复到正常水平,与正常对照组相较,差异均无统计学意义(分别为P=0.950,t/χ2=-0.063;P=0.983,t/χ2=1518.000; P=0.584, t/χ2=1468.500;P=0.742,t/χ2=1299.000)。8.患者接受甲磺酸伊马替尼治疗后,未达到缓解(包括部分缓解、血液学复发和耐药)时,血清bFGF、COX2、VEGF及TGFβ1水平与CR组比较差异显著,有统计学意义(分别为P0.001,t/χ2=-28.355;P0.001,t/χ2=630.000;P 0.001,t/χ2=137.000;P0.001,t/χ2=123.000)9.CML初诊患者治疗前血清bFGF、COX2及VEGF水平与TGFβ1水平呈负相关(分别为R=-0.315,P=0.026；R=-0.330,P=0.020；R=-0.632,P0.001)以上数据均采用SPSS20.0统计分析软件进行统计学分析。结论CML患者初诊时存在COX-2、VEGF及bFGF的高表达,TGFβ1在CML初诊时存在低表达,经过甲磺酸伊马替尼治疗后,达到完全缓解时,血清COX-2、VEGF、bFGF及TGFβ1含量基本恢复正常,提示与CML的发生、发展有密切关系。根据以上研究,说明动态监测CML患者血清COX-2、bFGF、TGFβ1及VEGF水平,可作为CML病情进展的重要参考指标。第三部分：白藜芦醇对K562细胞COX-2、bFGF、TGFβ1及VEGF基因表达的影响摘要目的：探讨COX-2、bFGF、TGFβ1及VEGF对人白血病细胞增殖的影响机制。方法：采用不同浓度白藜芦醇(Res)及伊马替尼(IM)对K562细胞进行干预,通过MTT法、台盼蓝染色、Hoechst 33258染色及流式细胞术观察细胞凋亡情况,同时将K562细胞株分为空白对照组、IM单药组(0.1μmol/L、0.2μmol/L)、Res单药组(50μmol/L)；100μmol/L)、200μmol/L)、IM联合Res组(IM0.1μmol/L+Res 50μmol/L、IM 0.1μmol/L+Res 100μmol/L、IM 0.1μmol/L+Res 200μmol/L、IM 0.2μmol/L+Res 50μmol/L、IM 0.2μmol/L+Res 100μmol/L、IM 0.2μmol/L+Res 200μmol/L)。采用荧光定量PCR及Western blot检测其给药后COX-2、bFGF、TGFβ1及VEGF的变化。结果：1、细胞抑制率随白藜芦醇及伊马替尼药物浓度的增高而呈上升趋势,各组间相比差异具有统计学意义(P0.05),与单独使用白藜芦醇或者伊马替尼相比,细胞增殖的抑制率明显增高,差异具有统计学意义(P0.05),其中200μmol/mL白藜芦醇+200μmol/L伊马替尼组细胞的抑制率最高；随着时间的延长,白藜芦醇与伊马替尼联合作用组细胞的增殖抑制作用明显增高,且当作用72 h时细胞的增殖抑制作用最高。2、台盼蓝拒染实验检测两种药物联合运用后对K562细胞的细胞毒作用。结果表明,各联合用药浓度组对K562细胞的细胞毒作用均高于单用白藜芦醇组和伊马替尼组,且当用200μmol/ml白藜芦醇+0.2μmol/L伊马替尼作用K562细胞时细胞的凋亡率最高；随着时间的延长,白藜芦醇与伊马替尼联合作用后使细胞的凋亡率明显增高,且当作用72 h时细胞凋亡率为最高。3、采用伊马替尼及白藜芦醇对CML细胞株caspase-3进行检测发现,随着白藜芦醇或伊马替尼浓度升高,其caspase-3活性逐渐增强。4、流式细胞术检测显示单用白藜芦醇及单用伊马替尼对人白血病细胞K562均具有凋亡作用,而随着白藜芦醇浓度的增加,K562细胞的凋亡率逐渐增高；随着伊马替尼浓度的增加,K562细胞的凋亡率逐渐上升。5、Hoechst 33258染色实验检测显示单用白藜芦醇及单用伊马替尼对人白血病细胞K562均具有凋亡作用,而随着白藜芦醇浓度的增加,K562细胞的凋亡率逐渐增高；随着伊马替尼浓度的增加,K562细胞的凋亡率逐渐上升。6.PCR及Western blot结果显示,相较于对照组,0.2μmol/L伊马替尼组的COX-2、bFGF及VEGF的表达量明显降低,而TGFβ1 mRNA的表达均显著增高,差异具有统计学意义(P0.05)；而用200μmol/mL白藜芦醇±0.2μmol/L伊马替尼联合作用于K562细胞后,细胞中TGFβ1 mRNA的表达明显增高,而COX-2、bFGF及VEGF mRNA的表达均显著降低,与对照组和0.2μmol/L伊马替尼组相比差异具有统计学意义(P0.05)。以上数据均采用SPSS20.0统计分析软件进行统计学分析。结论白藜芦醇及伊马替尼对白血病K562细胞株均具有促进凋亡作用,其联用可明显增加其凋亡率。对血管生成具有抑制作用的白藜芦醇能够增加TGFβ1 mRNA和蛋白的表达,减低COX-2、bFGF及VEGF mRNA和蛋白的表达,从而促进K562的凋亡,间接反映血管生成在白血病中的作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R733.7

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