阿霉素通过转录因子NF-κB诱导MCF-7细胞耐药并诱导一种新CD44st表达
发布时间:2018-05-23 10:59
本文选题:阿霉素 + CD44st ; 参考:《苏州大学》2015年博士论文
【摘要】:目的:1.应用阿霉素(doxorubicin)诱导乳腺癌细胞株MCF-7细胞产生多药耐药,以此耐药诱导模型为基础检测MDR1CD44st表达变化,探讨阿霉素诱导获得性多药耐药与肿瘤侵袭相关基因及其蛋白表达的关系;2.从MDR1CD44st基因转录调控入手,检测诱导获得性多药耐药过程中,转录因子NF-κB表达核移位及其与DNA的结合活性的变化,探讨NF-κB对MDR1CD44st表达的调控作用;3.应用NF-κB特异性抑制剂预处理后,再用透明质酸(hyaluronan HA)处理耐药诱导模型,检测肿瘤细胞MMP-2MMP-9表达及侵袭力变化,探讨NF-κB特异性抑制剂对HA诱导的侵袭能力影响。方法:应用四唑蓝(MTT)比色法检测不同浓度阿霉素对MCF-7细胞生长抑制的抑制效应,从而找到合适的阿霉素浓度进行药物的诱导;Quantitative Real-Time聚合酶链反应(q RT-PCR)及半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测MDR1、NF-κB、CD44st、MMP-2及MMP-9基因表达水平变化,基因测序验证CD44st基因;流式细胞技术(flow cytometry,FCM)细胞膜P-gp表达率的变化;罗丹明123(Rho123)潴留实验检测P-gp的功能状态;Western blotting检测CD44,NF-κB蛋白表达变化;凝胶迁移滞后实验(EMSA)检测NF-κB/DNA的结合活性;明胶酶谱分析检测细胞培养上清MMP-2,MMP-9表达变化;Transwell侵袭实验检测各实验组细胞侵袭力变化。结果:1.MTT结果显示:阿霉素对MCF-7细胞的IC50值为0.68±0.04 ug/m;应用0.01,0.03,0.06及0.12ug/ml浓度的阿霉素作用MCF-7细胞7天后,细胞生长均受到抑制,与阴性对照组比较,差异有统计学意义(P0.05);形态学观察,阿霉素在0.03,0.06ug/ml组细胞,7d后MCF-7细胞仅出现轻度肿胀,细胞状态尚好,而0.12ug/ml组细胞状态差,明显肿胀,可见明显的细胞碎片。因此,我们选择阿霉素的诱导终浓度为0.06 ug/ml用于后续研究。2.q RT-PCR结果显示,MCF-7细胞MDR-1,CD44st及NF-κB基因表达水平较低,经0.010.030.06 ug/ml阿霉素作用后,上述基因表达水平逐渐增高,并呈剂量依赖性;各处理组细胞与MCF-7细胞比较,及组间两两比较,差异有统计学差异(P0.05);RT-PCR结果与q RT-PCR结果相似;基因测序结果显示该CD44st基因序列与此前我们发现的基因序列(Gene Bank FJ216964)一致。3.流式细胞计数检测结果显示:MCF-7细胞组与各处理组比较,组间两两比较,P-gp表达率差异有统计学意义(P0.05)。4.Rho123外排实验显示:细胞内荧光强度随P-gp表达增加而逐渐减少,呈反比关系(P0.05)。5.Western blotting结果显示,CD44及NF-κB蛋白表达与m RNA表达变化相一致。6.EMSA检测结果表明,随着阿霉素用量的增加,NF-кB/DNA的结合活性呈剂量依赖性增加。7.RT-PCR及明胶酶谱结果显示,透明质酸(HA)诱导了MCF-7/A 0.06细胞分泌MMP-2和MMP-9,但这种作用可以被NF-кB特异性抑制剂BMS-345541所阻断。8.Transwell侵袭实验结果显示,HA可使MCF-7/A 0.06细胞侵袭力增强,而BMS-345541可阻断上述作用。结论:1.采用低剂量逐渐加量法,可成功诱导MCF-7细胞对阿霉素的多药耐药发生,同时细胞内MDR-1,CD44st,NF-κB基因及蛋白表达逐渐上调,并呈剂量依赖性。2.HA可以通过CD44st的上调,诱导多药耐药细胞分泌MMP-2和MMP-9增加,并影响肿瘤的侵袭力,而这种作用可以被NF-кB特异性抑制剂BMS-345541所阻断。
[Abstract]:Objective : To investigate the effect of adriamycin on the expression of MDR1 and MMP - 9 in breast cancer cell line MCF - 7 , and to investigate the effect of adriamycin on the expression of MDR1 and MMP - 9 in MCF - 7 cells . The results of RT - PCR and gelatin zymography showed that the expression of MMP - 2 and MMP - 9 in MCF - 7 / A - 0 . 06 cells increased with the increase of P - gp expression .
【学位授予单位】:苏州大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:R730.5
【参考文献】
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3 袁莲香,何伟民,张斌,谢凯圣,唐文瑜;乳腺癌组织MMP-2、MMP-9和TIMP-2蛋白表达与肿瘤的转移及预后[J];肿瘤;2002年04期
,本文编号:1924452
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