长链非编码RNA-UCA1对大肠癌细胞放射敏感性的影响及其机制初探
本文选题：长链非编码RNA + LncRNA-UCA1 ； 参考：《苏州大学》2016年硕士论文
【摘要】：目的:采用高通量测序筛选可能与大肠癌放射敏感性相关的长链非编码RNA(Long noncoding RNA,LncRNA),研究其对大肠癌细胞放射敏感性的影响及其机制。方法:(1)大肠癌辐射抵抗细胞株CCL244和大肠癌辐射敏感细胞株HCT116经6Gy X射线辐照后,通过lncRNA芯片技术筛选出X射线照射前后差异表达的lncRNA。(2)通过实时定量PCR技术检测lncRNA-UCA1在大肠癌组织及大肠癌细胞中的表达。(3)设计合成并筛选出该lncRNA-UCA1最有效的siRNA干扰序列。(4)siRNA转染CCL244细胞并联合6Gy X射线照射处理后,通过噻唑蓝比色法(MTT)、克隆形成实验、细胞凋亡、细胞周期、划痕实验及Western Blot实验分别检测细胞活力、增殖能力、细胞凋亡率、细胞周期分布、细胞迁移能力以及凋亡相关蛋白Caspase 3和Bcl-2、迁移相关蛋白MMP-2和MMP-9、上皮间充质转化(EMT)相关蛋白ZEB1和Vimentin蛋白的表达水平。结果:(1)LncRNA芯片测序结果显示大肠癌辐射抵抗细胞株CCL244经过X射线照射后lncRNA-UCA1表达水平升高最为明显,而辐射敏感细胞株HCT116经照射前后lncRNA-UCA1表达无统计学差异(2)32对临床组织样本中,与癌旁组织相比,肿瘤组织中lncRNA-UCA1相对表达水平为33.24±0.26,P0.001,其中有78.13%的患者lncRNA-UCA1表达水平相对升高;4对接受新辅助放化疗前后的患者临床样本中,放疗后组织中lnc RNA-UCA1相对于放疗前呈现高表达;与正常的肠上皮FHC细胞相比,lncRNA-UCA1在大肠癌HCT116、CCL244、SW480、LOVO细胞中相对高表达。(3)三条干扰序列分别转染CCL244细胞后,使用实时定量PCR检测lncRNA-UCA1的表达,发现siRNA-2的干扰效果最佳,干扰抑制率为57%(P0.001)。(4)下调CCL244细胞中lncRNA-UCA1表达联合6Gy X射线处理后,与单纯照射组相比,细胞活力明显下降(P0.001),平均致死剂量(D0)值分别为1.01Gy和1.69Gy,准阈剂量(Dq)值分别为1.91Gy和2.71Gy,放射增敏比SER为1.67,说明下调UCA1可以增加CCL244细胞的放射敏感性;下调lncRNA-UCA1表达联合6Gy X射线处理后,与单纯照射组相比,细胞凋亡率上升明显,差异均具有统计学意义(P0.001),凋亡相关蛋白Caspase-3表达水平上升,Bcl-2蛋白表达水平下降,同时G2/M期细胞比例降低,G2期阻滞情况得以缓解,差异有统计学意义(P0.01);下调lncRNA-UCA1表达后,CCL244细胞的迁移能力受到抑制(16.06±1.30)%vs(35.92±1.63)%,P0.05,迁移相关蛋白MMP2、MMP9和EMT相关蛋白ZEB1、Vimentin的表达水平均降低。结论:大肠癌辐射抵抗细胞株CCL244经X射线照射前后lncRNA-UCA1差异表达,下调其表达可以影响CCL244细胞的放射敏感性。
[Abstract]:Aim: to study the effects of LncRNAs on radiosensitivity of colorectal cancer cells by high throughput sequencing screening of LncRNAs, which may be related to radiosensitivity of colorectal cancer cells. Methods Radiation-resistant colorectal cancer cell line CCL244 and colorectal cancer radiosensitive cell line HCT116 were irradiated by 6Gy X-rays. LncRNA microarray was used to screen out the differential expression of LNcRNA.t2 before and after X-ray irradiation. The expression of lncRNA-UCA1 in colorectal cancer tissues and colorectal cancer cells was detected by real-time quantitative PCR technique. The lncRNA-UCA1 was designed and synthesized and the most effective siRNA interference sequence was screened out. After transfection of siRNA into CCL244 cells and 6Gy X-ray irradiation, Cell viability, proliferation ability, apoptosis rate and cell cycle distribution were determined by MTT assay, cell cycle, scratch test and Western Blot assay. The expression of apoptosis-related proteins Caspase 3 and Bcl-2, migration associated proteins MMP-2 and MMP-9, and epithelial mesenchymal transformation related proteins ZEB1 and Vimentin were detected. Results the results of DNA sequencing showed that the expression of lncRNA-UCA1 in the radiation-resistant colorectal cancer cell line CCL244 was significantly increased after X-ray irradiation, while the expression of lncRNA-UCA1 in the radiosensitive cell line HCT116 was not significantly different from that in the clinical tissue samples before and after irradiation. Compared with paracancerous tissues, the relative expression level of lncRNA-UCA1 in tumor tissues was 33.24 卤0.26g / P0.001. 78.13% of the patients had higher lncRNA-UCA1 expression than that of the patients before and after neoadjuvant radiotherapy and chemotherapy, and 78.13% of the patients had increased lncRNA-UCA1 expression in the clinical samples before and after neoadjuvant chemotherapy. Compared with normal intestinal epithelial FHC cells, the expression of lncRNA-UCA1 was detected by real-time quantitative PCR after three interfering sequences were transfected into CCL244 cells, respectively, and compared with those of normal intestinal epithelial FHC cells, and the expression of lncRNA-UCA1 was detected by real-time quantitative PCR after transfection of three interfering sequences into CCL244 cells of colorectal carcinoma HCT116, CCL244, SW480 and LOVO cells, respectively, and compared with normal intestinal epithelial FHC cells, the expression of lncRNA-UCA1 was detected by real-time quantitative PCR after transfection of three interfering sequences into CCL244 cells. It was found that the interference effect of siRNA-2 was the best, and the inhibition rate of interference was 57% (P 0.001N. P0. 4) after down-regulating the expression of lncRNA-UCA1 in CCL244 cells combined with 6Gy X ray treatment, the inhibition rate was higher than that in the control group. The mean lethal dose (D0) was 1.01Gy and 1.69 Gy, the quasi-threshold dose (DQ) was 1.91Gy and 2.71 Gy, the radiosensitization ratio was 1.67, which indicated that down-regulation of UCA1 could increase the radiosensitivity of CCL244 cells, and the down-regulation of lncRNA-UCA1 expression combined with 6Gy X ray treatment could increase the radiosensitivity of CCL244 cells. Compared with the control group, the rate of apoptosis increased significantly, the difference was statistically significant (P 0.001), the expression of apoptosis-related protein (Caspase-3) increased and the expression of Bcl-2 protein decreased, while the arrest of G 2 / M phase was alleviated. After down-regulation of lncRNA-UCA1 expression, the migration ability of CCL244 cells was inhibited by 16.06 卤1.30)%vs(35.92 卤1.63% P0.05, and the expression levels of MMP2mMP9 and EMT associated protein ZEB1 + Vimentin were decreased. Conclusion: the differential expression of lncRNA-UCA1 in radiation-resistant colorectal cancer cell line CCL244 before and after X-ray irradiation may affect the radiosensitivity of CCL244 cells.
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.34
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，本文编号：1924469
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