USP33抑制结直肠癌细胞上皮—间质转化及侵袭转移的作用与机制研究

发布时间：2018-05-27 04:17

  本文选题：β-arrestin2 + CXCR4　； 参考：《山东大学》2017年博士论文

【摘要】：结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是指发生于结肠或直肠中的癌症,是最常见的恶性肿瘤类型之一,其发病率逐年升高。结直肠癌预后与肿瘤分期密切相关,已经出现远处转移的晚期患者五年生存率低于15%。其中结直肠癌肝脏转移(Colorectal cancer liver metastasis,CRCLM)是导致患者死亡的重要原因,有 20-25%的结直肠癌患者初次确诊时已存在同时性肝转移(Synchronous liver metastasis)。即使对于根治性手术切除后的早期患者,仍然约有30%最终出现异时性肝转移(Metachronous liver metastasis),对于CRCLM患者的治疗方案取决于具体的临床状况和多学科评估,在患者耐受的情况下,手术切除仍然为最佳治疗策略。但即使对原发灶和转移灶均进行手术切除,患者术后肝内复发率仍然居高不下。因此对CRCLM患者的治疗及预后评估是提升结直肠癌整体生存率的关键。CRCLM是一个十分复杂的生物学过程,从解剖学的角度看,消化道的静脉血流汇入门静脉并进入肝脏,因此肝脏是消化道肿瘤细胞最容易着床的脏器,癌细胞脱落并进入血循环后,很容易在肝脏形成转移灶。从肿瘤细胞的角度看,影响肿瘤转移的因素包括细胞黏附、细胞增殖、细胞迁移侵袭、肿瘤微环境等。虽然结直肠癌肝脏转移的分子生物学机制尚不完全明确,但普遍认为趋化因子-趋化因子受体(Chemokine receptor)和上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程发挥重要作用。CXCR4(C-X-C chemokine receptor type 4)是一种重要的趋化因子受体家族成员,属于G蛋白偶联受体(G protein coupled receptors,GPCRs)家族,可被多种趋化因子激活并介导肿瘤细胞迁移过程。CXCR4最主要的配体为CXCL12(C-X-C motif chemokine 12),又称为 SDF-1(Stromal cell-derived factor 1)。肿瘤细胞表面受体CXCR4受到SDF-1刺激后,可激活G蛋白偶联的信号通路,调控下游EMT分子的表达及肿瘤细胞生物学特性。CXCR4被激活后会迅速发生由β-arrestin2蛋白所介导的受体内吞过程,该内吞过程受到CXCR4和β-arrestin2蛋白的磷酸化、泛素化等翻译后修饰(Post-translational modification,PTM)调控。泛素特异性蛋白酶USP33(Ubiquitin-specific protease 33)属于泛素特异性蛋白酶家族(Ubiquitin-specific proteases,USPs)成员之一,能够调控底物的"去泛素化"过程,拮抗泛素连接酶(Ubiquitin ligases)所介导的泛素化修饰。USP33已被报道可参与调控多种GPCR的内吞过程,包括β2肾上腺素受体(β2 adrenergic receptor,β2AR)和血管加压素受体 II(Vasopressin receptor type 2,V2R)等;但 USP33 在肿瘤细胞侵袭转移中的作用研究较少,其在结直肠癌中的表达、功能和分子生物学机制仍需进一步探索。本研究首次探索了 USP33在CRCLM患者肿瘤组织中的表达变化,分析其与患者临床病理特征和预后的相关性,证实USP33蛋白表达水平对CRCLM患者预后的指导意义。此外,本课题表明USP33可抑制β-arrestin2所介导的CXCR4内吞过程,阻断其下游β-arrestin2依赖性ERK通路,从而下调结直肠癌细胞EMT蛋白表达及侵袭转移能力。本研究不仅进一步明确了 USP33调控结直肠癌细胞侵袭转移的机制,同时也阐明了 β-arrestin依赖性的GPCR信号通路在肿瘤发生发展中的关键作用。第一部分泛素特异性蛋白酶USP33与结直肠癌临床病理特征和预后的相关性[目的]检测CRCLM患者肿瘤组织(原发肿瘤和肝转移肿瘤)中USP33的表达,并分析其与患者临床病理特征之间的相关性,同时统计学分析评估USP33对CRCLM患者的总生存率(Overall survival,OS)和无病生存率(Disease-free survival,DFS)的预测价值。[方法]1.收集山东大学齐鲁医院、山东大学千佛山医院、单县中心医院和郓城市人民医院手术切除的结直肠癌原发肿瘤(CRC)、结直肠癌肝转移肿瘤(CRCLM)及对应癌旁石蜡组织,并制成石蜡组织切片,进行免疫组织化学染色实验检测肿瘤组织及癌旁组织中USP33的蛋白表达及亚细胞定位,统计分析其与肿瘤病理特性、病人分期等相关性。2.收集山东大学齐鲁医院、山东大学千佛山医院、单县中心医院和郓城市人民医院手术切除的CRC、CRCLM及对应癌旁新鲜组织,运用逆转录定量PCR(Reverse transcription quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-qPCR)手段检测肿瘤组织及癌旁组织中USP33的mRNA水平。3.收集山东大学齐鲁医院、山东大学千佛山医院、单县中心医院和郓城市人民医院手术切除的CRC、CRCLM及对应癌旁新鲜组织,利用蛋白免疫印迹(Western blot)手段检测肿瘤组织及癌旁组织中USP33的蛋白水平。4.回顾性统计分析病人生存资料,记录其总生存时间和无病生存时间,进行Kaplan-meier生存分析和Cox多因素风险回归分析,寻找影响CRCLM患者预后的危险因素。[结果]1.收集139例CRCLM患者手术切除石蜡组织,免疫组织化学染色结果表明,USP33主要定位于细胞质中,且在CRC及CRCLM肿瘤组织中表达水平均低于对应的癌旁组织。CRC中的USP33蛋白水平与CRC浸润深度、肝转移灶数目和淋巴结转移相关;CRCLM中的USP33蛋白水平与原发肿瘤浸润深度和淋巴结转移相关。2.收集14例CRCLM患者手术切除新鲜组织及对应癌旁组织,RT-qPCR结果显示,有9例(9/14,64.3%)患者CRC组织中USP33的mRNA水平低于癌旁结直肠组织,有12例(12/14,85.7%)患者CRCLM中USP33的mRNA水平低于癌旁肝脏组织。3.14例CRCLM患者手术切除新鲜组织及对应癌旁组织的Western blot结果表明,有10例(10/14,71.4%)患者原发灶中USP33的蛋白水平低于癌旁结直肠组织,有12例(12/14,85.7%)患者肝转移灶中USP33的蛋白水平低于癌旁肝脏组织。该结果基本与mRNA检测结果一致。4.单因素分析结果显示,CRCLM的分布、CRCLM数目、CRCLM最大肿瘤直径、分化程度、手术切缘均可影响CRCLM患者的总生存率;此外,淋巴结转移、肝外转移以及USP33在肿瘤组织中的表达水平,也可影响患者的整体预后生存。影响患者肿瘤复发的因素包括:CRC浸润深度、CRCLM分布、CRCLM数目、CRCLM最大肿瘤直径、分化程度、手术切缘、淋巴结转移,以及CRCLM中USP33的表达水平。多因素分析进一步证实CRCLM中USP33的蛋白表达水平可作为独立预后因素提示患者总生存及无病生存状况。[结论]1.USP33在结直肠癌原发肿瘤及肝转移肿瘤中的表达水平均低于对应癌旁组织,其可能在结直肠癌中发挥抑癌作用。2.USP33与CRCLM病理特征及分期明显相关,USP33表达量低提示肿瘤细胞侵袭转移作用更强。3.USP33在CRCLM中的表达水平可作为独立危险因素提示患者预后。第二部分USP33调控结直肠癌细胞上皮-间质转化和侵袭转移作用的研究[目的]基于第一部分临床结果表明,USP33在CRC组织和CRCLM组织中表达量均低于癌旁正常组织,且其表达水平与肿瘤分期密切相关。本部分研究通过体外细胞实验进一步验证USP33在结直肠癌细胞上皮-间质转化、细胞增殖和侵袭转移中的作用。[方法]1.选用正常结直肠上皮细胞和多种结直肠癌细胞系,应用Western blot的方法,检测USP33的表达水平差异。2.构建带有HA标签的pcDNA3.1-USP33高表达质粒(HA-USP33)及空白对照质粒(Vector),订购USP33特异性小干扰RNA(USP33-siRNA)及对照组siRNA(Negative control siRNA,NC-siRNA),分别转染结直肠癌细胞以构建 USP33高表达及低表达细胞系,并利用Western blot的方法检测转染效率。3.对转染后的USP33高表达及低表达细胞分别进行光学显微镜下观察,确定其是否存在细胞形态改变等表型变化。对细胞进行SDF-1刺激,利用Western blot方法检测EMT相关蛋白的表达变化。4.利用USP33高表达及低表达的细胞系,对细胞进行SDF-1刺激,进行MTT实验检测USP33对结直肠癌细胞增殖的影响;进行划痕实验(Wound healing assay)和Transwell实验分别检测USP33对肿瘤细胞迁移侵袭能力的影响。[结果]1.USP33在正常结肠上皮细胞NCM460细胞中的表达量显著高于其在结直肠癌细胞系(SW620细胞、SW480细胞、LoVo细胞)中的表达水平。在三种结肠癌细胞系中,SW620细胞的USP33表达量最低,SW480细胞表达量最高,LoVo细胞表达量居中。2.成功构建质粒HA-USP33,并选用LoVo细胞系分别进行HA-USP33及USP33-siRNA转染,经Western blot验证转染效率及USP33蛋白表达水平。3.光学显微镜下观察发现,USP33高表达可抑制LoVo细胞由上皮细胞形态向间质细胞形态转化。Western blot结果显示,USP33高表达可抑制EMT标志性蛋白表达(β-catenin,N-cadherin,Snail,Slug,Twist1),同时上调上皮细胞标志物 E-cadherin的表达;而USP33低表达细胞则呈现与上述结果相反的EMT蛋白变化趋势。4.MTT实验结果证实USP33可抑制LoVo细胞的增殖能力,划痕实验和Transwell实验表明USP33可抑制结直肠癌细胞的迁移侵袭能力。[结论]1.USP33可抑制SDF-1诱导的结直肠癌细胞的EMT过程。2.USP33可抑制SDF-1诱导的结直肠癌细胞迁移侵袭过程。第三部分USP33抑制结直肠癌细胞肿瘤生物学特性的分子机制研究[目的]上述研究已证实USP33可通过下调EMT蛋白进而抑制结直肠癌细胞的侵袭转移过程,本部分实验将从分子生物学角度入手,进一步探索USP33调控结直肠癌细胞侵袭转移的具体分子机制。[方法]1.检测SDF-1所对应的趋化因子受体CXCR4在临床病理组织(CRC组织,CRCLM组织及对应癌旁组织)中的表达情况。2.应用RT-qPCR和Western blot的手段,分别检测CXCR4在不同结直肠癌细胞系中的mRNA及蛋白水平。3.构建USP33失活突变(C214S/H683Q),并将其克隆入HA-pcDNA3.1载体质粒中(HA-USP33Cys:His),对LoVo 细胞进行 HA-USP33Cys His 转染。4.对转染HA-USP33Cys:His的LoVo细胞分别进行MTT实验和Transwell实验,以探索USP33的去泛素化酶活性对其抑癌功能的影响。5.利用细胞表面受体ELISA的手段,检测USP33对CXCR4受体的内吞、降解及再循环回膜过程的影响。6.通过免疫共沉淀实验,探索USP33与β-arrestin2的相互作用,并检测USP33对β-arrestin2泛素化水平及蛋白降解的影响。7.检测β-arrestin2在临床病理组织(CRC组织,CRCLM组织及对应癌旁组织)中的表达情况,并进行统计学检验,评估其与USP33表达水平的相关性。8.利用 Western blot 的手段,检测 USP33 对 CXCR4 下游 ERK(Extracellular signal-regulated kinases)通路的影响。通过对细胞进行内吞抑制剂(Dynasore)预处理,验证USP33是否通过调控CXCR4内吞过程从而影响下游ERK通路。9.对USP33低表达的LoVo细胞进行内吞抑制剂预处理,并给予SDF-1刺激,通过MTT和Transwell实验分别检测CXCR4内吞失调对结直肠癌细胞增殖和迁移侵袭能力的影响。[结果]1.CXCR4在CRC组织中的表达量高于癌旁结直肠组织,CXCR4在CRCLM组织中的表达量高于癌旁肝脏组织。2.CXCR4在不同结直肠癌细胞系中的mRNA水平对比如下:SW480LoVoSW620。Western blot检测的蛋白水平差异与mRNA结果基本一致。3.经DNA测序证实HA-USP33Cys:His质粒构建成功,经Western blot实验证实HA-USp33Cys:His 转染成功。4.MTT及Transwell实验显示HA-USP33能够抑制LoVo细胞的增殖及侵袭转移能力,而HA-USP33Cys:His转染并不能抑制LoVo细胞的肿瘤生物学特性。5.USP33可抑制SDF-1刺激后的CXCR4受体内吞及降解过程。6.免疫沉淀实验表明,SDF-1刺激后,USP33可与β-arrestin2蛋白结合,并下调β-arrestin2的泛素化水平,但USP33并不影响β-arrestin2的总蛋白水平。7.β-arrestin2在CRC和CRCLM肿瘤组织中的表达量均高于癌旁正常组织,但统计学分析并未发现β-arrestin2与USP33蛋白水平的显著相关性。8.USP33低表达能够延长CXCR4下游的ERK活化持续时间,但给予内吞抑制剂预处理后,该延长作用消失。9.USP33-siRNA可增强LoVo细胞的增殖和迁移侵袭能力,而给予内吞抑制剂预处理后,该作用被显著削弱。[结论]1.USP33的去泛素化酶活性是其发挥抑癌作用的关键。2.USP33可下调β-arrestin2的泛素化水平,且其泛素化修饰可能影响β-arrestin2的蛋白活性,而非蛋白降解。3.USP33通过下调β-arrestin2的泛素化,抑制CXCR4的内吞过程,致使SDF-1刺激后的CXCR4仅脱敏(desensitization)但不内吞,从而阻滞了 CXCR4内吞后由β-arrestin2 介导的 ERK 活化(β-arrestin-mediated ERK signaling),进而下调结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.34
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本文编号：1940382