MicroRNA-148a通过靶向调控DLGAP1促进神经胶质瘤细胞的转移

发布时间：2018-05-28 04:18

  本文选题：神经胶质瘤 + microRNA　； 参考：《湖南师范大学》2016年硕士论文

【摘要】：目的:Mir-148a是一种重要的微小RNA(microRNA,miRNA),其表达水平的异常与多种恶性肿瘤的发生、发展有密切联系。通过前期对大样本基因组数据的挖掘,建立了一个完整mRNAs和microRNAs的神经胶质母细胞瘤(GBM)分子预后模型,发现mir-148a和DLGAP1(discs,large homolog associated protein 1)在GBM中分别呈现高表达和低表达并与病人的生存相关,生物信息学预测发现DLGAP1是mir-148a的潜在靶基因。本课题以人神经胶质瘤组织标本、人神经胶质瘤细胞系为研究对象,研究mir-148a在神经胶质瘤组织标本和神经胶质瘤细胞系中的表达水平的变化;构建mir-148a过表达(pre-mir-148a)和mir-148a抑制表达(anti-mir-148a)慢病毒,筛选并建立稳定高表达及抑制表达mir-148a的神经胶质瘤细胞系;研究mir-148a对神经胶质瘤细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭能力的影响;验证mir-148a与DLGAP1之间的靶向关系并研究其功能。为进一步诠释GBM发生发展的分子机制和应用mir-148a作为GBM诊断和治疗的新靶点奠定基础。方法:1、运用组织芯片及原位杂交的方法检测人神经胶质瘤组织标中本mir-148a的表达水平,运用qRT-PCR方法检测人神经胶质瘤细胞系中mir-148a的表达水平;2、根据人mir-148a序列设计并合成前体mir-148a及mir-148a反向互补序列,构建mir-148a过表达慢病毒和mir-148a抑制表达慢病毒;感染神经胶质瘤细胞系并通过嘌呤霉素筛选及qRT-PCR检测mir-148a表达水平,在神经胶质瘤细胞系中建立mir-148a过表达及抑制表达稳定细胞系;3、通过edu实验、cck8实验、平板克隆形成实验评价mir-148a对神经胶质瘤细胞增殖能力的影响;通过划痕实验、transwell迁移及侵袭实验评价mir-148a对神经胶质瘤细胞迁移和侵袭能力的影响;通过流式细胞术评价mir-148a对神经胶质瘤细胞凋亡情况的影响。4、运用组织芯片和免疫组织化学的方法检测不同级别神经胶质瘤组织标本及正常对照脑组织中dlgap1的表达,运用qrt-pcr、westernblot方法检测人神经胶质瘤细胞系中dlgap1的表达;5、运用生物信息学和荧光素酶报告基因实验验证dlgap1是否是mir-148a的靶基因,并通过qrt-pcr、westernblot方法检测感染了mir-148a过表达或抑制表达慢病毒的细胞系中靶基因mrna水平和蛋白水平的变化;通过transwell迁移、侵袭实验来验证mir-148a通过靶向调控dlgap1促进神经胶质瘤细胞的迁移、侵袭。结果:1、mir-148a在神经胶质瘤和正常脑组织中均有表达,与正常脑组织中的mir-148a表达水平相比较,不同级别的胶质瘤组织中mir-148a表达上调,肿瘤组织与正常组织之间的mir-148a的表达水平差异具有统计学意义(p0.05)。与在组织中mir-148a表达水平检测结果相似,mir-148a在正常神经胶质细胞ha1800和神经胶质瘤细胞系u87、u251、bt325、t98g、swo38-c2中均有表达,与ha1800中mir-148a表达水平相比较,mir-148a在u87、u251、bt325、t98g、swo38-c2中的表达明显上调,肿瘤细胞与正常细胞之间的mir-148a的表达水平差异具有统计学意义(p0.05)。2、成功构建了mir-148a过表达慢病毒载体及mir-148a抑制表达慢病毒载体,并通过嘌呤霉素筛选及qpcr获得稳定过表达mir-148a及抑制表达mir-148a的u87、u251、bt325、t98g稳定细胞系。3、cck8实验、edu实验、平板克隆实验证实mir-148a过表达能够促进u87、u251、bt325、t98g细胞的增殖,mir-148a表达下调抑制u87、u251、bt325、t98g细胞的增殖;划痕实验、transwell迁移实验、transwell侵袭实验证实mir-148a过表达促进u87、u251、bt325的迁移和侵袭,抑制mir-148a表达时抑制了u87、u251、bt325的迁移和侵袭;annexinvpe/7-aad染色检测凋亡结果发现mir-148a过表达抑制u87、bt325、t98g的凋亡,而mir-148a下调时促进了u87、bt325的凋亡。4、dlgap1在神经胶质瘤组织和细胞中均有表达,相比较与正常神经胶质细胞,dlgap1在神经胶质瘤细胞中表达下调,包括基因水平和蛋白水平,dlgap1在正常细胞与神经胶质瘤中的表达水平差异具有统计学意义(p0.05);免疫组织化学实验检测结果显示dlgap1阳性率随神经胶质瘤良恶性级别的增高而相应减少,不同级别的胶质瘤之间的dlgap1表达水平的差异具有统计学意义(p0.05);靶基因预测到mir-148a与dlgap1之间存在靶向相关性,构建荧光素酶报告基因质粒,通过与mir-148a过表达慢病毒共转染293t细胞,荧光素酶报告基因荧光强度减弱,即活性降低,证明mir-148a可以直接作用于dlgap1-3’utr靶序列,下调dlgap1的表达;qpcr、westernblot验证表明mir-148a过表达时抑制dlgap1基因水平、蛋白水平的表达,mir-148a表达下调时,dlgap1基因水平、蛋白表达水平上调,证实mir-148a对dlgap1存在调控作用;shrna-dlgap1慢病毒载体感染u87、u251、bt325后进行transwell迁移、侵袭实验,结果发现dlgap1受到抑制时u87、u251、bt325的迁移、侵袭能力增强。结论:1、神经胶质瘤中,mir-148a高表达、dlgap1低表达,两者表达呈负相关性;mir-148a靶向抑制DLGAP1的表达;2、成功构建了稳定过表达mir-148a及抑制表达mir-148a的稳定细胞系;3、mir-148a促进神经胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭,抑制神经胶质瘤细胞的凋亡;4、DLGAP1是mir-148a的一个靶基因;mir-148a通过靶向调控DLGAP1促进神经胶质瘤细胞的迁移与侵袭。
[Abstract]:Objective : To investigate the effect of mir - 148a on glioma cell proliferation , apoptosis , migration and invasion ability of glioma cells . The expression of mir - 148a in glioma and normal brain tissues was significantly higher than that of mir - 148a in normal brain tissues . The expression level of mir - 148a was significantly higher than that of mir - 148a in normal brain tissues . The results showed that the expression of dlgap1 and dlgap1 in glioma cells decreased significantly ( p < 0.05 ) . mir - 148a promotes migration and invasion of glioma cells by targeting the DLGAP1 .
【学位授予单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.4
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本文编号：1945256