长链非编码RNA PlncRNA-1作为内源性竞争RNA调控雄激素受体表达促进前列腺癌进展的作用及机制研究

发布时间：2018-05-30 13:28

本文选题：长链非编码RNA + 内源竞争性RNA　；参考：《第二军医大学》2016年博士论文

【摘要】：最新的研究显示2015年男性前列腺癌的发生率已达26%,预计的死亡率更高达9%。成为继肺癌后排名第二位的致死性肿瘤。前列腺癌的发生发展是一个非常复杂和动态变化的过程,包括了多种基因的变化。人类基因组中具有能够编码能力的基因有20000个,在2007年,发现了在多种生物过程中有着起重要作用的非编码RNA。能够在多种生物学过程中起到重要作用。在不同种属中的很多长链非编码RNA能够最大限度的改变我们对于细胞生物的理解,特别是在对于病理性疾病的认识上,以肿瘤性疾病最为突出。早期lnc RNA能够在肿瘤发生中起到非常重要的作用。已经在前列腺癌中报道过的长链非编码RNA非常多,包括PCA3,PCAT-1,PCAT-29,PCGEM1,PRNCR1以及CTBP1-AS,这些都是已经报道在前列腺癌中发挥重要作用的长链非编码RNA。我们已经知道前列腺癌的所有阶段都是依赖AR信号通路起作用的。并且依赖其增殖和存活。雄激素介导的长链非编码RNA在前列腺癌中的作用是非常重要的。前期我们通过RNA-Seq对14对前列腺癌及其癌旁组织进行RNA深度测序,首次发现the prostate cancer up-regulated long non-coding RNA1(Plnc RNA-1)在前列腺癌组织中表达普遍高于癌旁组织,提示Plnc RNA-1可能在PCa的进展中起到重要作用。此后,我们运用si RNA技术干扰Plnc RNA-1后,细胞中雄激素受体AR表达量明显降低,细胞的增殖、迁移均下降,并且促进其凋亡,但其与雄激素受体(AR)相互调节的具体机制未明。本研究构建了稳定过表达及干扰Plnc RNA-1的前列腺癌细胞株,并在细胞水平及动物水平明确了其促癌的功能。运用了Real-time PCR及Northern blot鉴定了Plnc RNA-1的优势剪切体,以及运用原位杂交实验以及核质分离实验检测了Plnc RNA-1在细胞中的定位,运用mi Randa预测软件进行靶向Plnc RNA-1的mi RNA的预测,然后用双荧光素酶报告基因检测试验验证,发现能与Plnc RNA-1相互作用的mi R-34c-5p,以及mi R-297-3p,并应用Real-time PCR发现这两个mi RNA同样能靶向AR,并在体外水平研究了这两个mi RNA在对前列腺癌细胞的增殖以及凋亡的作用,并检测在人前列腺癌组织中Plnc RNA-1以及这两个mi RNA的表达量并分析其相关性。本研究将稳定过表达及干扰Plnc RNA-1的前列腺癌细胞株在裸鼠上进行荷瘤,发现其促癌作用体内及体外一致。进一步机制研究表明Plnc RNA-1的优势功能剪切体为最短的一条(V3),并且其主要富集在胞质,通过mi Randa预测软件进行Plnc RNA-1靶位点的预测,本研究为其筛到了能与之相互作用的mi R-34c-5p以及mi R-297-3p,并且发现这两个mi RNA能与雄激素受体作用,并且能抑制前列腺细胞的增殖以及促进其凋亡,与Plnc RNA-1的作用相反。同时在人前列腺癌与癌旁组织中发现Plnc RNA-1在癌组织中的表达量与这两个mi RNA的表达是呈现负相关的,与AR是呈现正相关的,并在前列腺癌病人的血浆中检测到这条lnc RNA的表达量是高于非前列腺癌病人。本研究证实Plnc RNA-1作为内源竞争性RNA(ce RNA),通过抑制mi R-34c-5p,mi R-297-3p来促进AR的表达,从而促进前列腺癌的进展,首次报道前列腺癌中的长链非编码RNA能作为ce RNA与雄激素受体作用的机制,并提示了Plnc RNA-1可能作为前列腺癌治疗的一个潜在靶点以及可能作为诊断前列腺癌的生物标志物。第一部分长链非编码RNA Plnc RNA-1的鉴定方法:(1)通过UCSC基因数据库显示Plnc RNA-1的具体基因定位及转录剪切体。(2)利用RT-PCR和Nothern blot进行Plnc RNA-1剪切体的的检测,并且在泌尿系统肿瘤细胞系中进行检测。(3)利用FISH和核质分离实验对Plnc RNA-1进行细胞定位。(4)利用RT-PCR和Western Blot对Plnc RNA-1和AR的关系进行验证。(5)通过RIP实验验证Plnc RNA-1和AR是否直接结合。结果:(1)发现Plnc RNA-1共有三条转录剪切体,而且长度各异,分别是CBR3-AS1v1(1575bp),CBR3-AS1 v2(1500bp)以及CBR3-AS1 v3(743bp)。(2)发现v3是前列腺癌中表达最高的,也是之前报道过有功能的Plnc RNA-1.并且在泌尿系统肿瘤细胞系中表达量最高。(3)FISH和核质分离实验发现Plnc RNA-1主要位于细胞质。(4)在LNCa P和22RV1细胞中干扰Plnc RNA-1后,AR m RNA及蛋白的表达是下调的。过表达Plnc RNA-1后,AR m RNA及蛋白的表达是上调的。(5)RIP实验验证Plnc RNA-1和AR不能结合。结论:Plnc RNA-1是CBR3-AS1 v3,主要位于细胞质,能够调控AR的表达,但是不能与AR直接结合。第二部分:AR对长链非编码RNA Plnc RNA-1的转录调控作用研究方法:(1)通过在LNCa P细胞中添加10n M DHT后检测不同时间Plnc RNA-1的表达量。同时以不同浓度梯度的DHT,分别是0,0.01,1,10,100n M的雄激素去刺激LNCa P细胞48h后,检测Plnc RNA-1的表达量。(2)同时利用干扰RNA,在LNCa P中干扰AR,检测Plnc RNA-1的表达。(3)构建Plnc RNA-1的启动子到报告基因上,并用雄激素及雄激素拮抗剂加入到细胞中检测报告基因的活性。(4)通过PROMO预测软件预测Plnc RNA-1启动子上是否有AR的结合位点,并利用染色体免疫共沉淀实验验证Plnc RNA-1的启动子能与AR是否结合。结果:(1)发现加入DHT后,LNCa P细胞中的Plnc RNA-1的表达量随着时间是上调的,加入不同浓度的DHT刺激LNCa P后,发现Plnc RNA-1的表达量也是随着浓度的增加而不断上调。(2)在LNCa P细胞中干扰AR后,发现Plnc RNA-1的表达也是下调的。(3)加入雄激素后,报告基因的活性是上调的,加入雄激素抑制剂后,报告基因的活性是下调的。(4)通过PROMO预测软件预测出在Plnc RNA-1的启动子上游1500bp的区域有三个预测位点。同时通过CHIP验证出了这三个位点确实能与AR结合。结论:体外实验证实长链非编码Plnc RNA-1是AR启动的长链非编码RNA。第三部分:Plnc RNA-1促进AR表达上调的内源性竞争RNA机制研究方法:(1)生物信息学分析筛选出靶向Plnc RNA-1的mi RNA。(2)利用干扰RNA技术干扰Plnc RNA-1后,RT-PCR检测筛选出的mi RNA的表达,初步筛选出与Plnc RNA-1作用的mi RNA.(3)通过在LNCa P细胞中转染mi R-297-3p,mi R-34c-5p mimics验证是否能与Plnc RNA-1和AR相互作用。(4)通过生物信息学将这两条mi RNA靶向AR3’UTR的区域进行了匹配,并将片段构建报告基因,验证筛选出的mi RNA是否能作用使其荧光活性降低(5)利用mi RNA作用位点突变实验研究mi RNA对于Plnc RNA-1的影响是否依赖于与mi RNA的结合位点。(6)RNA免疫共沉淀研究Plnc RNA-1与mi RNA是否直接结合Ago2,参与RISC复合物,竞争实验验证Plnc RNA-1是否与AR相互竞争。(7)RNA免疫共沉淀研究Plnc RNA-1是否与mi RNA直接结合。结果:(1)生物信息学分析筛选出13条靶向Plnc RNA-1的mi RNA。(2)干扰Plnc RNA-1后,进一步筛选出mi R-297-3p和mi R-34c-5p为能于Plnc RNA-1相互作用的mi RNA。(3)mi R-297-3p和mi R-34c-5p能够影响AR3’UTR以及Plnc RNA-1野生型片段的活性,但不能影响突变掉mi RNA结合位点的Plnc RNA-1片段的活性。(4)RNA免疫共沉淀证实Plnc RNA-1与mi R-34c-5p以及mi R-297-3p直接结合到Ago2,并且能与AR互相竞争。(5)RNA免疫共沉淀实验证实Plnc RNA-1与mi RNA直接结合结论:体外实验证实长链非编码RNA Plnc RNA-1能够上调AR,mi RNA参与Plnc RNA-1对AR的调控过程。第四部分:Plnc RNA-1促进前列腺癌细胞增殖,迁移和凋亡抵抗的作用分析方法:(1)CCK-8细胞活性检测试剂盒检测Plnc RNA-1对于前列腺癌细胞的增殖影响。凋亡试剂盒检测Plnc RNA-1对于前列腺癌细胞的凋亡影响。Transwell实验检测Plnc RNA-1对于前列腺癌细胞的迁移能力影响。细胞周期试剂盒检测Plnc RNA-1对于前列腺癌细胞的周期影响。(2)检测mi R-297-3p以及mi R-34c-5p对于前列腺癌细胞的增殖,凋亡影响。(3)在LNCa P细胞中通过转染过表达慢病毒(LV-Plnc RNA-1)过表达Plnc RNA-1,以及干扰慢病毒(LV-si Plnc RNA-1)体内实验研究Plnc RNA-1促癌的作用,并且也在22RV1细胞中检验。(4)在裸鼠荷瘤上检测Plnc RNA-1在体内对AR以及相应mi RNA的影响。结果:(1)CCK-8细胞活性检测试剂盒及细胞周期试剂盒发现Plnc RNA-1能够促进前列腺癌细胞增殖。凋亡试剂盒检测Plnc RNA-1能够减少前列腺癌细胞凋亡.Transwell实验能够促进前列腺癌细胞迁移,并且这些效应的产生依赖于AR的介导。(2)通过增殖,凋亡检测mi R-297-3p以及mi R-34c-5p对前列腺癌细胞的影响,发现其效应与Plnc RNA-1效应相反。(3)在LNCa P细胞中过表达Plnc RNA-1以及干扰Plnc RNA-1后,将细胞荷瘤于裸鼠上发现,过表达Plnc RNA-1组与对照组相比,瘤子体积明显增大,干扰Plnc RNA-1组与对照组比,瘤子体积明显减小,同样效应在22RV1细胞中也有。(4)通过检测荷瘤里面的Plnc RNA-1,AR以及相应mi RNA的变化,发现过表达Plnc RNA-1后,AR有明显上调,mi R-297-3p和mi R-34c-5p是相应下调的,干扰Plnc RNA-1后,AR是明显下调的,mi R-297-3p和mi R-34c-5p是相应上调的。结论:通过增殖,凋亡,周期表明Plnc RNA-1能为前列腺癌细胞的癌基因。与其相互作用的mi R-297-3p以及mi R-34c-5p可能为前列腺癌细胞的抑癌基因,两者在体内的效应也是互相抑制。第五部分:Plnc RNA-1相关基因在前列腺癌临床病理诊断中的意义研究方法:(1)通过RT-PCR检测16对前列腺癌组织以及癌旁组织中Plnc RNA-1以及相应mi RNA的表达。并利用原位杂交验证Plnc RNA-1以及相应mi RNA在前列腺癌组织中的表达。并通过RT-PCR检测48个前列腺癌组织中Plnc RNA-1相关基因的表达(2)通过RT-PCR检测37个穿刺阳性的前列腺癌病人以及35个穿刺阴性的血里面的Plnc RNA-1的含量。结果:(1)通过检测16对配对的癌与癌旁中Plnc RNA-1,mi R-297-3p,mi R-34c-5p的表达,发现Plnc RNA-1与mi R-297-3p以及mi R-34c-5p的表达是呈负相关。进一步检测48个前列腺癌组织中Plnc RNA-1,AR,mi R-297-3p,mi R-34c-5p的表达,发现Plnc RNA-1与AR是正相关,与Bcl-x L基因也是正相关,与mi R-297-3p以及mi R-34c-5p是负相关。(2)通过检测37个穿刺阳性的前列腺癌病人以及35个穿刺阴性的血里面的Plnc RNA-1的含量,发现穿刺阳性Plnc RNA-1的含量是明显高于穿刺阴性的病人。结论:前列腺癌病人组织中确实有Plnc RNA-1表达的上调,相应mi R-297-3p以及mi R-34c-5p的变化。前列腺癌病人的血中也能检测到Plnc RNA-1的存在,并且可能成为诊断前列腺癌的生物标志物。小结本论文中,主要针对前列腺癌发生发展中关键的长链非编码RNA进行功能及作用机制的研究。通过构建Plnc RNA-1的过表达及干扰的细胞系,并在细胞水平及动物水平证实其促癌的功能,在机制研究中,通过多种策略系统性的研究了Plnc RNA-1的优势剪切体,胞内定位。提示了其在胞浆中稳定存在并有可能发挥调控作用。进一步的生物信息学预测及双荧光素酶报告基因验证发现了Plnc RNA-1可以直接作用于mi R-34c及mi R-297,并通过靶基因预测和相关研究证实了两个mi RNA可以靶向AR,同时证明了mi RNA在前列腺癌发生发展中同时具有作用。最终在体内样本中证实Plnc RNA-1与两个mi RNA的相关性,综合全论文,在此前发现AR调控Plnc RNA-1的基础上,本文系统性地证实了Plnc RNA-1通过靶向吸附mi RNA调控AR的内源性竞争性mi RNA的海绵机制,从而描述了AR-Plnc RNA-1之间形成的正反馈促进机制,对于认识AR相关的前列腺癌发生具有重要意义。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.25

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