成纤维细胞生长因子受体4基因沉默对胃癌生物学功能影响的研究及其临床意义

发布时间：2018-05-31 09:41

本文选题：成纤维细胞生长因子受体4 + 胃癌　；参考：《郑州大学》2015年博士论文

【摘要】：胃癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一,在亚洲尤其是在我国的发病率甚高。在我国,早期胃癌的发现率约为20%,远低于韩国和日本等其他亚洲国家。胃癌的发现常在癌症晚期或者因转移性胃癌而被发现。在我国胃癌多为进展期,并且预后比较差,常需要通过手术治疗为主、放化疗等为辅的综合治疗。目前,胃癌的辅助化疗、姑息化疗的方案很多,如顺铂+氟尿嘧啶、氟尿嘧啶+奥沙利铂、DCF、ECF等,其中以氟尿嘧啶为基础化疗药物。由于胃癌发病机制的复杂性和不确定性,目前胃癌治疗的生存时间并不理想,无论是美国的NCCN指南还是欧洲肿瘤医学协会(ESMO)均没有治疗胃癌的标准方案。尽管近年来靶向药物在胃癌研究领域非常热门,但是由于胃癌的发生发展一个是具有多因素、多阶段和多种基因共同参与的过程,其发病机制并不清楚；目前除了赫塞丁外,多数药物如贝伐珠单抗、爱必妥等药物在胃癌研究中并未取得突破。所以寻找新的靶基因,阐明胃癌的发生发展机制对有效治疗胃癌有着重要的作用。由近年来靶向药物的相关研究可以看出,EGFR. VEGF等相关信号通路药物在肺癌、乳腺癌等一些恶性肿瘤治疗中取得了突破性进展,但是这些研究对胃癌治疗并无作用。因此寻求新的治疗靶点是胃癌治疗的一大任务。近年来,对于FGFR (Fibroblast growth factor recptor)的研究日益增多,成纤维细胞生长因子受体(FGFRs)是免疫球蛋白基因超家族成员,分布在多种细胞膜上,其中以FGFR4多肽性位点Gly388Arg研究最多。FGFR4基因编码的蛋白是一类跨膜酪氨酸激酶受体,为分布在多种细胞上的膜蛋白。它对细胞的增殖、分化、创伤修复、血管生成、肌肉形成以及生长发育等都起着极其重要的作用。有研究发现,该种蛋白在多种肿瘤中均有表达异常,如胰腺癌、乳腺癌等,因此FGFR家族在恶性肿瘤诊治方面有着广阔的应用前景。但迄今为止,FGFR4在胃癌中的研究很少,并且研究不够深入。一些报道显示BGJ398与FGFR家族有很好的亲和力和选择性,并且BGJ398能够抑制肝癌细胞增殖。有研究报道,BGJ398能够通过抑制FGFR4酪氨酸磷酸化,从而起到抑制FGFR4活性的作用,与此同时,BGJ398还能够抑制FGFR1和FGFR3的活性。迄今发现的20多种成纤维细胞生长因子(FGF)中有10个能与FGFR4结合,其中仅有FGF19与FGFR4特异性结合。FGFR4激活后能够使FGF19促进肝细胞增殖,诱导肝癌形成。部分研究证明,BGJ398能够逆转FGF19特异性的刺激AFP产量增加,从而推测BGJ398能够抑制FGFR4的活性。由于目前FGFR4在胃癌中的研究较少,因此本课题着重探讨FGFR4在胃癌发生发展中的作用,为胃癌的早期诊断、预后以及基因治疗提供强有力的理论依据。通过体内体外功能学检测FGFR4在胃癌及癌旁正常组织中的表达异同,探讨成纤维细胞生长因子受体4(FGFR4)在胃癌(GC)发生发展中的功能,并探讨其治疗价值。本课题前两部分主要从基因水平、mRNA水平和蛋白水平上对FGFR4分子与胃癌的相关性进行研究,并通过体外实验,研究FGFR4对胃癌细胞株生物学特性的影响；然后通过慢病毒构建FGFR4 RNAi,用于裸鼠胃癌模型的建立,进行TUNEL及免疫组化等体内相关实验,检测胃癌生物学特性相关蛋白以及表达变化。同时进一步研究5-Fu、BGJ398单药或联合用药干预慢病毒处理的细胞株,观察其对胃癌细胞株生物学行为的影响,从而探讨这些药物的作用机制,进而更全面的研究FGFR4在胃癌发生发展中的作用,为BGJ398应用于胃癌临床治疗提供理论依据,也为胃癌的预后提供新的评价指标。第一部分成纤维细胞生长因子受体4在胃癌中作用的功能研究第一章成纤维细胞生长因子受体4在胃癌细胞系中作用的功能研究背景与目的：胃癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一,其发病率占第四位。在我国,早期胃癌的发现率仅为20%,并且大多是在癌症晚期或者因转移性胃癌而被发现,因此预后比较差,常需要以手术治疗为主、放化疗等为辅的综合治疗。目前,胃癌的辅助化疗、姑息化疗的方案很多,其中以铂类和氟尿嘧啶为一线药物,如顺铂+氟尿嘧啶、氟尿嘧啶+奥沙利铂、DCF、ECF等,但其生存时间并不理想。近年来,靶向药物在胃癌的治疗中成为一大热点。但除了赫塞丁外,多数药物在胃癌研究中并未取得突破。所以寻找新的治疗靶基因,阐明胃癌的发生发展机制对治疗胃癌有着重要作用。成纤维细胞生长因子(FGFRs)是免疫球蛋白基因超家族成员,分布在多种细胞膜上,其中以FGFR4多肽性位点Gly388Arg研究最多。FGFR4编码的蛋白是一类跨膜酪氨酸激酶受体,为主要分布在多种细胞上的膜蛋白。它对细胞的增殖、分化、创伤修复、血管生成、肌肉形成以及生长发育等都起着极其重要的作用。有研究发现,该种蛋白在多种肿瘤中均表达异常,如胰腺癌、乳腺癌等,因此FGFR家族在恶性肿瘤诊治方面有着广阔的应用前景。但迄今为止,FGFR4在胃癌中的研究很少,并且研究不够深入。本研究通过慢病毒载体介导,构建成FGFR4基因沉默细胞株,研究FGFR4基因沉默后对胃癌细胞系增殖能力、侵袭能力以及凋亡的影响。检测不同处理组效应蛋白表达的变化,探讨FGFR4基因沉默后对胃癌细胞生物学行为影响的机制。方法：利用Real-time PCR检测FGFR4在胃癌细胞系HGC27、MKN45、MKN28、 MGC803、BGC823、SGC7901和293T中的表达情况,筛选出高表达细胞。构建FGFR4基因沉默细胞株,通过CCK8检测基因沉默细胞株和正常细胞株增殖情况的改变。流式细胞分选仪检测FGFR4基因沉默后对胃癌细胞系凋七的影响,以及通过Transwell检测其侵袭能力的改变。Western Blot检测不同处理组效应蛋白表达的变化。结果：本研究构建成功FGFR4基因沉默细胞株,分别设正常细胞组、阴性质粒组以及FGFR4基因沉默细胞组。其中FGFR4基因沉默后的细胞组较正常组及阴性质粒对照组的增值率和侵袭能力明显降低,凋亡率增高,PCNA和Bcl-xl的表达降低。结论：本研究从不同恶性程度的胃癌细胞株中筛选出两株FGFR4高表达细胞株,并通过慢病毒转染将其构建成FGFR4基因沉默胃癌细胞株,通过研究其基因沉默后细胞的增殖能力、侵袭能力、凋亡情况以及以上指标相关蛋白,发现FGFR4基因沉默后的胃癌细胞株增殖能力减弱、凋亡率增加、侵袭能力降低,提示FGFR4能够促进胃癌细胞生长,增加其恶性程度,促进胃癌细胞侵袭性。第二章成纤维细胞生长因子受体4在裸鼠成瘤中作用的研究背景与目的：FGFR4在常见的恶性肿瘤如胰腺癌、横纹肌肉瘤、乳腺癌以及肾细胞癌中均呈高表达。迄今发现的20多种成纤维细胞生长因子(FGF)中仅有10种能与FGFR4结合,其中仅FGF19能够与FGFR4特异性结合。目前FGFR4在胃癌中的研究比较少,因此本课题着重探讨FGFR4在胃癌发生发展中的作用,为胃癌的早期诊断、预后以及基因治疗提供强有力的理论依据。方法：将FGFR4基因沉默细胞株和相应未处理的胃癌细胞株皮下注射至裸鼠背部,构建裸鼠胃癌模型。接种6-8周后,观测不同处理组成瘤体积、大小指标的变化。通过TUNEL法检测不同组的组织中细胞凋亡情况。通过免疫组化检测增殖和凋亡相关蛋白,分析FGFR4基因沉默后其对胃癌组织生长的影响。结果：皮下注射FGFR4基因沉默后的HGC27和MKN45细胞株的裸鼠瘤体积明显小于阴性对照组和空白对照组,且此差异具有统计学意义(P0.05)。此差异尤其在细胞注射后第10天,13天和16天最为明显。通过TUNEL法检测组织中细胞凋亡情况,发现FGFR4基因沉默组细胞凋亡增加。通过免疫组织化学的方法检测FGFR4基因沉默组的PCNA、BCL-XL表达降低,Caspase3的表达增高。结论：FGFR4基因沉默后能够抑制胃癌细胞在体内的增长,增加细胞凋亡。所以,我们推测低表达FGFR4基因的蛋白可能会减缓晚期胃癌的进展。第二部分成纤维细胞生长因子受体4抑制剂和5-Fu在胃癌中作用机制的研究背景与目的BGJ398与FGFR家族有很好的亲和力和选择性,并且BGJ398能够抑制肝癌细胞增殖。有研究报道,BGJ398能够抑制FGFR4酪氨酸磷酸化,从而起到抑制FGFR4活性的作用,与此同时,BGJ398还能够抑制FGFR1和FGFR3的活性。迄今发现的20多种成纤维生长因子(FGF)中有10个能与FGFR4结合,其中仅有FGF19与FGFR4特异性结合。FGFR4激活后能够使FGF19促进肝细胞增殖,诱导肝癌形成。部分研究证明,BGJ398能够逆转FGF19特异性的刺激AFP产量增加,从而推测BGJ398能够抑制FGFR4的活性。此外,BGJ398对FGFR4高表达的肝癌细胞株HuH7d的抗增殖作用显著强于FGFR4低表达的肝癌细胞株及非癌细胞株,因此进一步说明FGFR4相对于其他FGFRs亚型而言,BGJ398对其作用的影响更大。FGFR4在胃癌中的研究甚少,因此我们将着重探讨FGFR4在胃癌发生发展中的作用。方法BGJ398和5-Fu单药或两药联合处理FGFR4基因沉默的细胞株,分别以各自未行处理的细胞株作为对照,进行一系列体外功能学试验,评价BGJ398和5-Fu对FGFR4低表达水平胃癌细胞株生物学行为的影响。同时在分子水平上检测不同处理因素作用后,细胞增殖,侵袭,凋亡及细胞周期相关蛋白表达的变化。结果：单用5-Fu和BGJ398以及两药联合后对胃癌细胞MKN45和HGC27的细胞增殖起到抑制作用,且增加了细胞的凋亡率。将这两株细胞通过转染技术构建FGFR4基因沉默细胞株后,细胞对5-Fu和BGJ398以及两药联合的敏感度增加,细胞增殖所受的抑制作用增加,凋亡率较未基因沉默的细胞株增加。结论：单用5-Fu和BGJ398以及两药联合后对胃癌细胞株MKN45和HGC27的细胞增殖起到抑制作用,且增加细胞的凋亡率。基因沉默FGFR4能够增加5-Fu和BGJ398对胃癌细胞株的增值抑制作用。全文结论：通过转染慢病毒构建FGFR4基因沉默胃癌细胞株,进行体内体外功能学实验。FGFR4基因沉默后通过减少肿瘤细胞的侵袭能力和增殖能力来增加肿瘤细胞的凋亡,降低肿瘤的恶性程度。将5-Fu和BGJ398单用及两药联合处理正常胃癌细胞株后,发现单用和联合治疗均能降低细胞增殖,增加细胞凋亡率。此细胞增殖的抑制作用和凋亡情况的增加在FGFR4基因沉默后的胃癌细胞株中更为明显。但5-Fu和BGJ398的联合治疗的价值和前景还需要我们进一步验证,为临床提供治疗依据。
[Abstract]:Gastric cancer is one of the most common malignant tumors in the world . In China , the incidence of gastric cancer is very high . In China , the rate of early gastric cancer is about 20 % , which is much lower than other Asian countries such as South Korea and Japan .
In addition to Herceding , most of the drugs , such as beatazuresis and Aibijing , have not made a breakthrough in the study of gastric cancer . Therefore , it is important to find a new target gene and to clarify the mechanism of development of gastric cancer . It can be seen that EGFR is a target drug in recent years . In recent years , it has been found that BGJ398 can inhibit FGFR4 activity . In recent years , it has been found that BGJ398 can inhibit FGFR4 activity .
Objective : To study the role of FGFR4 in gastric cancer , and to study the role of FGFR4 in gastric cancer . The expression of FGFR4 gene in gastric cancer cell line HGC27 , MKN45 , MKN28 , MGC803 , BGC823 , MKN28 , MGC803 , BGC823 , MKN28 , MGC803 , BGC823 , MKN28 , MGC803 , BGC823 , MKN28 , MGC803 , BGC823 , MKN28 , MGC803 , BGC823 , MKN28 , MGC803 , BGC823 , MKN28 , MGC803 , BGC823 , MKN28 , MGC803 , BGC823 , MKN28 , MGC803 , BGC823 , MKN28 , MGC803 , BGC823 , MKN28 , MGC803 , BGC823 , MKN28 , MGC803 , BGC823 , MKN28 , MGC803 , BGC823 , MKN28 , MGC803 , BGC823 , MKN28 , MGC803 , BGC823 , MKN28 , MGC803 and BGC823 were detected by Western Blot . Conclusion : BGJ398 can inhibit the growth of gastric cancer cells and increase cell apoptosis . In addition , BGJ398 can inhibit FGFR4 activity .
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.2

【参考文献】