p53与Doxorubicin共传递多孔微球的制备及对人肺癌A549细胞影响的研究

发布时间：2018-05-31 13:14

  本文选题：多孔微球 + 阿霉素　； 参考：《吉林大学》2015年博士论文

【摘要】：研究背景： 肺癌，是近年来死亡率最高的癌症之一，且患病率呈持续升高的趋势。随着肺癌患者的增多，有效治疗肺癌的方法成为越来越多科研工作者关注的焦点与难点。目前，肺癌治疗的主要策略是手术切除、化学疗法和放射疗法。我们已经知道放射疗法虽然具有治疗局部损伤的优势，但对正常组织细胞中DNA也存在损伤，肿瘤也不易彻底治愈，疗效不高；化学药物疗法存在全身巨大毒副作用，在抑制肿瘤细胞的同时，产生的毒副作用给患者带来痛苦，又因较为昂贵，有些不能做为一线用药；对于基因疗法（生物疗法之一）来说，常被应用于放、化疗补充或辅助治疗之中。阿霉素作为一种重要的非特异性抗肿瘤抗生素被广泛应用于卵巢癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、白血病等癌症的治疗，抑癌基因p53因在许多癌症形成过程中起关键作用，也已被用于头颈癌、肝癌、卵巢癌等II、III期临床试验研究中。针对于肺癌的治疗，更多的科研人员正致力于开发安全、高效、无（低）副作用的肺部原位吸入给药系统。可吸入式多孔微球是其中的一个研究热点，迄今主要的载体材料是安全无毒的生物可降解高分子聚合物聚乳酸羟基乙酸（PLGA）。 癌症是细胞增殖与细胞凋亡失衡的结果，肿瘤细胞中细胞凋亡过程受阻，癌细胞“无限增殖”、肆意横行，是引发癌症的主要原因。在细胞凋亡的过程中，线粒体扮演着一个及其重要的角色，它对细胞内钙离子浓度、线粒体膜电位的维持都起着至关重要的作用。 需氧生物细胞中氧化还原反应体系的平衡，是维持正常生理活动必需的重要保证，一旦受到内外刺激打破体内原有的氧化还原平衡时，就会产生氧化应激损伤。伴随而来，会产生活性氧等各种类型的自由基。由于机体存在抗氧化与清除自由基防御体系共筑的五道防线，即细胞色素氧化酶、抗氧化酶、抗氧化（清除）剂、自由基损伤修复和细胞凋亡这五道屏障，体内的还原状态与能力将对氧化应激进行保护。若肿瘤部位的还原系统遭到破坏，则会保留氧化应激状态，使此部位细胞通过线粒体途径产生凋亡。 寻找肺癌吸入治疗PLGA多孔微球载体，实现阿霉素与p53抑癌基因的共传递是本研究亟待解决的重要问题。阿霉素与p53共传递多孔微球能否有效作用于人肺癌细胞系A549细胞，是把握药物与基因共传递多孔微球作为肺癌吸入治疗的关键环节。如果该肺癌吸入给药系统效果较佳，其分子作用机制是否与活性氧（ROS）介导线粒体细胞凋亡有关，是揭示共传递肺癌吸入给药生物功效本质的更深入地探索。 目的： 研制针对肺癌吸入给药的阿霉素与p53共传递多孔微球。 意义： 提供肺癌吸入给药治疗的化学药物与抑癌基因协同效应的新方法。 方法： 本文采用PLGA作为载体材料，制备了同时载有阿霉素和p53-PEI基因纳米复合物的多孔微球——PMS-Dox/p53，建立了阿霉素的液相色谱检测方法；分析了对多孔微球的外观结构产生影响的诸多因素（致孔剂浓度、PLGA浓度、均质转速）；选择优化处方进行一系列理化性质表征（粒径、电位、包封率、体外释放等）。应用此处方制备的各组多孔微球（PMS-Dox、PMS-p53、PMS-Dox/p53）观察对人肺腺癌细胞系A549作用，检测了PMS-Dox/p53对A549细胞形态学（细胞核形态学、细胞迁移能力）及细胞凋亡情况的影响。同时应用蛋白免疫印迹法检测了PMS-Dox/p53对A549细胞凋亡相关蛋白因子P53、Caspase3、Caspase8、Caspase9、Bcl-2及Bax蛋白表达情况的影响，并检测了Caspase3、Caspase8、Caspase9的活性。进一步探讨了PMS-Dox/p53组多孔微球使A549细胞产生凋亡时，与线粒体途径相关因子关联性及其发生的变化，包括ROS含量、羟自由基含量、线粒体膜电位，细胞内Ca2+浓度、细胞色素C细胞内定位及各种抗氧化酶类（剂）活性的影响，探讨PMS-Dox/p53多孔微球引起A549细胞凋亡的分子作用机制。 结果： 1.确定了阿霉素的最佳高效液相色谱条件为Ascentis dC18色谱分析柱，流动相为0.01M醋酸钠：甲醇=30:70，冰醋酸调pH为4.0，检测波长为254nm。确定了空载多孔微球的最佳处方反应制备条件：致孔剂浓度10%，PLGA浓度25%，均质转速3000rpm。研制出外形圆整、粒径均一（约20μm左右）、多孔结构清晰的多孔微球。 2.载入p53-PEI纳米复合物时PEI与p53质粒的质量比为0.4。此条件下的p53-PEI纳米复合物具有183.4±90.1nm的粒径和17.4±9.8mV的电位。 3.成功地同时将化疗药物阿霉素（Dox）和抑癌基因p53质粒载入多孔微球，制备成PMS-Dox/p53。此多孔微球粒径为22.87±11.79μm并略具正电性。Dox和p53-PEI纳米复合物的包封率分别达到88.2±1.7%和36.5±7.5%。多孔微球的载体材料安全、无毒、可降解，载药后可持续释放7天，达到缓、控释效果。其中，，Dox的释放要迟于p53-PEI纳米复合物的释放。 4.各组载药多孔微球作用于人肺腺癌A549细胞，发现PMS-Dox、PMS-p53、PMS-Dox/p53组多孔微球均使A549细胞的存活率降低，并可诱导其凋亡。DAPI染色法观察细胞核形态、结晶紫染色法观察细胞全貌及细胞划痕法观察细胞迁移率等一系列形态学研究发现，各载药组多孔微球均出现染色质凝集、核皱缩、边缘羽化及迁移能力下降。 5.载药多孔微球引起A549细胞凋亡，也引起了一系列与细胞凋亡相关因子表达水平的改变，包括抑癌基因p53的上调，促凋亡因子Bax的上调，Caspase3、Caspase9的上调、抗凋亡因子Bcl-2的下调。在对Caspase3、Caspase8及Caspase9活性的检测中，Caspase3、Caspase9的活性均有所增加，Caspase8的活性几乎不变，证实载药多孔微球引起A549细胞凋亡过程可能与线粒体凋亡途径有关。 6.检测与线粒体途径有关标志性指标的变化。发现载药多孔微球作用A549细胞时，会引起ROS含量迅速增加，细胞内线粒体膜电位下降，细胞内Ca2+浓度升高，抗氧化酶类SOD、CAT、GPx活性均有所降低，同时抗氧化剂GSH含量下降，细胞色素C从线粒体释放进入胞浆。表明载药多孔微球作用A549细胞确与ROS及线粒体凋亡密切相关。且以PMS-Dox/p53组多孔微球的作用效果最为明显，对肺癌吸入给药具有极大优势和潜力，推测与化疗药物Dox和抑癌基因p53具有协同效应有关。 结论： 根据多孔微球制备、载药能力与缓、控释及对人肺腺癌细胞A549的影响，主要创新研究结论为： 1.研制出结构均一、外观圆整、粒径20μm、电位为正，包封率达标、适于肺部吸入给药的共传递多孔微球——PMS-Dox/p53。 2.载体骨架材料为生物可降解聚合物PLGA，安全、无毒、且可在体内降解、符合肺部给药要求，可使多孔微球达到缓释效果。 3.共传递多孔微球PMS-Dox/p53，可抑制A549细胞存活率，引起A549细胞凋亡，并使A549细胞中与凋亡相关的因子发生变化，促凋亡因子上调，抗凋亡因子下调，与其他组相比，凋亡效果最明显。 4.确定ROS介导的线粒体凋亡通路是共传递多孔微球PMS-Dox/p53的分子作用机制。 综上所述，本研究制备的PMS-Dox/p53多孔微球，可能为肺癌的治疗提供化学治疗与基因治疗协同吸入给药的新方法。
[Abstract]:Background of Study :

Lung cancer is one of the highest mortality rates in recent years , and the prevalence of lung cancer is increasing continuously . With the increase of lung cancer patients , the method of effective treatment of lung cancer has become the focus and difficulty of more and more researchers .
the chemical medicine therapy has the great toxic and side effect of the whole body , and the toxic and side effects caused by the toxic and side effects caused by the inhibition of the tumor cells can cause pain to the patient , and the medicament is expensive and can not be used as a first - line drug ;
As an important non - specific antitumor antibiotic , it is widely used in the treatment of ovarian cancer , breast cancer , lung cancer , liver cancer , leukemia and other cancers .

Cancer is the result of cell proliferation and cell apoptosis . The cell apoptosis in tumor cells is blocked , and the cancer cell " unlimited proliferation " is the main cause of cancer . In the process of cell apoptosis , mitochondria play an important role , which plays an important role in the maintenance of intracellular calcium ion concentration and mitochondrial membrane potential .

The oxidation - reduction reaction system in aerobic biological cells is an important guarantee for maintaining normal physiological activities . When the internal and external stimuli break the original redox equilibrium in vivo , oxidative stress injury can be generated . As the organism has five barrier lines , such as cytochrome oxidase , antioxidant enzyme , anti - oxidation ( scavenging ) agent , free - radical damage repair and apoptosis , the oxidation stress can be protected . If the reduction system of tumor site is damaged , the state of oxidative stress can be maintained , and the cell can induce apoptosis through the mitochondrial pathway .

It is an important issue to solve the co - transmission of adriamycin with p53 tumor suppressor gene . It is an important issue to solve the problem that the co - transfer of adriamycin and p53 to human lung cancer cell line A549 is a key link in the treatment of lung cancer .

Purpose :

A porous microsphere was developed for the co - delivery of adriamycin and p53 to lung cancer .

Meaning :

a novel method of providing a synergistic effect between a chemical drug for lung cancer inhalation administration and a cancer suppressor gene is provided .

Method :

In this paper , a porous microsphere _ PMS - Dox / p53 containing adriamycin and p53 - PEI gene nanocomposites was prepared by PLGA as a carrier material , and a liquid chromatography detection method for adriamycin was established .
The factors affecting the appearance structure of porous microspheres were analyzed ( pore concentration , PLGA concentration , homogeneous rotation speed ) .
A series of physical and chemical properties ( particle size , potential , encapsulation rate , in vitro release , etc . ) were selected to optimize the prescription . The effects of PMS - Dox / p53 on the morphology of A549 cells ( nuclear morphology , cell migration ability ) and apoptosis of A549 cells were observed by using the porous microspheres ( PMS - Dox , PMS - p53 , PMS - Dox / p53 ) prepared herein . The effects of PMS - Dox / p53 on the expression of apoptosis - related protein factors P53 , Caspase - 3 , Caspase8 , Caspase9 , Bcl - 2 and Bax were detected by Western blot .

Results :

1 . The optimal high performance liquid chromatographic conditions of adriamycin were determined as Ascaris dC18 chromatographic column . The mobile phase was 0.01M sodium acetate : methanol = 30 鈭

本文编号：1959822