HGF在髓系白血病细胞中的表达及其对白血病细胞的作用研究

发布时间：2018-06-05 22:43

本文选题：髓系白血病 + HGF　；参考：《福建医科大学》2015年博士论文

【摘要】：目的:研究HGF在髓系白血病细胞中的表达及其作用。方法:1.收集91例急性髓系白血病初诊未治疗患者、41例急性髓系白血病缓解患者、32例正常人的骨髓标本,利用实时定量RT-PCR(q RT-PCR)及Western Blot方法分别从转录水平和翻译水平检测髓系白血病细胞中HGF及其相关基因c-Met、HGFA、HAI-1、HAI-2、Matriptase m RNA与蛋白表达水平;比较上述基因在人急性髓系白血病患者初诊未治疗组、缓解组及健康对照组中的表达情况;分析上述基因的表达情况与人急性髓系白血病初诊未治疗患者中部分临床资料的相关性;2.利用慢病毒载体表达短发卡RNA(sh RNA)在髓系白血病细胞Kasumi-1、HL60中下调HGF表达;q RT-PCR及Western Blot验证HGF sh RNA的沉默效果;3.观察HGF基因沉默后细胞生物学行为变化:CCK-8法检测细胞增殖能力;克隆形成实验检测细胞克隆形成能力;流式细胞术(FCM)检测细胞周期和凋亡的变化;DAPI荧光染色法观察细胞凋亡形态;FN粘附实验检测细胞粘附能力;Transwell小室侵袭实验检测细胞侵袭能力;Western blot检测细胞增殖凋亡、周期相关蛋白表达水平及HGF下游PI3K-AKT、MAPK/ERK等信号通路改变。结果:1.HGF m RNA水平在AML初诊未治疗组、AML缓解组和健康对照组中的相对表达量(2-△CT)中位数分别为:8.096х10-3、1.271х10-3、2.598х10-3;HGF在AML初诊未治疗组的表达高于AML缓解组和健康对照组(p值分别为0.0002、0.0149);c-Met m RNA水平在AML初诊未治疗组、AML缓解组和健康对照组中的相对表达量(2-△CT)中位数分别为:3.988х10-3、0.231х10-3、0.497х10-3;c-Met在AML初诊未治疗组的表达高于AML缓解组和健康对照组(p值分别为0.0002、0.0150)。在AML初诊未治疗组HGFA水平高于健康对照组;而HAI-2 m RNA水平则低于健康对照组,但均与AML缓解组无统计学差别。HAI-1、Matriptase m RNA水平在各组中均无明显变化。HGF表达水平与急性髓系白血病未治疗未治疗患者的性别、年龄、血红蛋白、血小板水平、首疗程缓解情况没有直接的相关性,但其水平在高白细胞组、预后差的人群中表达较高,p值分别为0.0405、0.009,有统计学意义;HAI-1表达水平在预后分组差的人群中表达较高(p=0.0462)。而在高白细胞组中HAI-2 m RNA表达较低(p=0.03902)。2.成功建立稳定干扰HGF的Kasumi-1、HL-60细胞株:q RT-PCR检测显示干扰组细胞HGF m RNA表达水平均下调。相对于对照组,干扰HGF的Kasumi-1、HL60细胞HGF m RNA含量分别下调77.31%、86.36%。Western blot结果亦验证干扰了HGF的上述两株细胞HGF蛋白表达有明显下调。3.HGF基因沉默对稳定株细胞增殖、凋亡和细胞侵袭能力的影响:a.CCK-8结果显示HGF RNAi抑制Kasumi-1、HL60细胞增殖,day5时与阴性对照组相比,干扰组细胞增殖抑制率分别为54.16%、49.04%;b.克隆形成显示:HGF RNAi后Kasumi-1、HL-60细胞的克隆形成能力受到抑制,克隆形成抑制率分别为35.95%、60.12%;c.流式细胞仪检测细胞周期结果显示:HGF基因沉默后,两株细胞的G2/M期细胞比例增多,S期细胞比例降低,说明细胞周期G2-M期转换受到阻滞。d.细胞凋亡检测结果显示:Kasumi-1细胞中未转染病毒组(Normal control组)、空载阴性对照组(Negative Control组)和干扰组(Knock Down组)细胞的总凋亡率分别为0.20%、5.86%及16.46%;而HL60细胞中未转染病毒组(control组)、阴性对照组(NC组)和干扰组(KD组)细胞的总凋亡率分别为0.12%、2.48%及14.45%,两株干扰组细胞凋亡率与对照组比较均显著增高(p值分别为0.001、0.015)。e.FN粘附实验、Transwell小室试验结果显示:Kasumi-1、HL60细胞干扰后粘附细胞数分别下降33.57%、51.54%,与对照组比较有统计学意义(p值分别为0.00、0.001);Kasumi-1、HL60细胞干扰后穿膜细胞数分别下降22.19%、27.26%,与对照组比较有统计学意义(p值分别为0.001、0.000),提示HGF基因沉默后细胞粘附及侵袭能力受到抑制。f.Western Blot检测结果显示:HGF RNAi后下调Kasumi-1细胞Bad、Bcl-XL、Bcl-2、CDK1、Cyclin B、MMP2、MMP9等蛋白表达下调;cleaved caspase9、cleaved caspase3、cleaved PARP、Bax、P21蛋白表达上调;c-Met、AKT、Erk、m TOR等蛋白磷酸化水平降低;Chk1、cdc25、PTEN磷酸化水平增高;对t-Akt、t-Raf、MMP7、pro-caspase8等蛋白影响不大。在HL-60细胞中,Bcl-2、P21蛋白含量变化不明显,而Bax表达量增高,GSK3β磷酸化水平增高,而PTEN磷酸化水平无明显变化。结论:1.HGF基因在急性髓系白血病细胞中高表达,且其表达水平与外周血白细胞数和预后相关,治疗缓解后HGF表达较前降低。c-Met、HGFA基因在急性髓系白血病中表达增高。HAI-2基因在急性髓系白血病中表达下调,且与外周血白细胞数相关。2.HGF可能通过PI3K-AKT、MAPK/Erk通路促进急性髓系白血病细胞的增殖与侵袭转移,下调HGF基因表达可抑制急性髓系白血病细胞的增殖及侵袭能力,促使其阻滞于G2/M期,发生caspase介导的凋亡。
[Abstract]:Objective : To study the expression of HGF in acute myeloid leukemia ( AML ) cells and to investigate the effect of HGF on the expression of HGF and its related genes c - Met , HFA , HAI - 1 , HAI - 2 , Matriptimim RNA and protein in acute myeloid leukemia ( AML ) . The results showed that HGF could inhibit the proliferation , apoptosis and cell invasion ability of HL - 60 cells . In HL - 60 cells , the expression levels of Bcl - 2 and P21 protein were decreased by 33.57 % and 51.54 % respectively .
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R733.7

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