miRNA-192-5p在多发性骨髓瘤中的临床价值及发病机制中的作用研究

发布时间：2018-06-05 23:51

本文选题：多发性骨髓瘤 + 循环微小RNA　；参考：《第二军医大学》2017年硕士论文

【摘要】：多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是一个复杂的恶性血液系统疾病,其特征是骨髓中浆细胞异常克隆性增殖,并大量的分泌单克隆免疫球蛋白及其片段,以致多数MM患者有不同程度的骨骼、肾脏等组织器官的损伤。MM发病率仅次于非霍奇金淋巴瘤,约占所有血液肿瘤的13%。MM主要好发于老年人,年龄大多在50-75岁之间,男女比例3:2。国际骨髓瘤工作组对多发性骨髓瘤制定的诊断标准为:骨髓中克隆性浆细胞的比例≥10%和(或)活组织检查证实存在有浆细胞瘤,血液和尿液中有单克隆免疫球蛋白,另外有贫血、高钙血症、骨质破坏、肾功能损害以及免疫缺陷等的骨髓瘤相关的终末器官和组织损伤。多发性骨髓瘤的发病机制复杂,主要涉及到骨髓微环境、遗传学上的基因突变、DNA甲基化和组蛋白修饰等调控方式。在临床治疗中,尽管免疫调节因子(来那度胺、泊马度胺)或蛋白酶体抑制剂(硼替佐米、卡非佐米)等新兴疗法显著提高了患者的治疗反应率和总体生存率,但MM仍然不可治愈。随着分子生物学技术的发展,越来越多的研究表明,非编码RNA,特别是微小RNA(micro RNA,miRNA)在多发性骨髓瘤的发病过程中起着尤为重要的作用。miRNA是一类短的内源性单链非编码调控RNA分子,约有18~25个核苷酸大小,通过结合特定信使RNAs的3’端非编码区(3'-untranslated region,3'-UTR)在转录后水平调节靶基因的表达。近年来的研究发现,miRNA分子在多种不同的肿瘤类型中均发现有异常表达,这些miRNA分子作为肿瘤抑制或促进因子调节肿瘤细胞的增殖、迁移、细胞周期以及分化等方面。循环miRNA分子具有作为新型生物标志物的潜力。在实体肿瘤中,例如乳腺癌患者的循环血浆miR-195表达增高,而且miR-195的异常表达有别于其他癌症患者和健康人群。另外,与健康对照人群相比,循环血浆miR-195和let-7a在乳腺癌术后患者中的表达水平显著下降。在血液系统恶性肿瘤中,急性淋巴细胞白血病患者的循环血清miR-128明显高表达,但在急性髓系白血病和正常对照组之间表达无明显差异;循环血清let-7b和miRNA-233在AML和ALL患者表达均高于对照组;表明循环血清miR-128、let-7b和miRNA-233对白血病的诊断和分型有一定的参考价值。基于以上介绍,我们提出以下疑问:循环miRNA分子在MM患者外周血清中是否也有异常表达?异常表达的循环miRNA与MM的诊断及预后有无关联呢?它们在MM的发病机制中又起着怎样的作用?为了解决这些问题,本课题运用基因芯片、荧光定量PCR、大量数据统计分析、流式细胞学等技术进行了以下三部分的研究:1)多发性骨髓瘤血清中异常表达的miRNA分子的筛选与鉴定;2)所筛选出来的循环miRNA分子:miRNA-192-5p在不同疾病阶段的多发性骨髓瘤血清中的表达水平及其与临床参数的相关性分析;3)miRNA-192-5p在多发性骨髓瘤发病机制中的作用。第一部分:多发性骨髓瘤血清中异常表达的miRNA分子有研究发现,一些特定的异常表达的miRNA分子在大部分肿瘤患者的外周血清中均可检出,并且称这些miRNA分子为循环miRNA分子。循环miRNA不仅具有显著的肿瘤相关性和组织特异性,还具有良好的稳定性。另外,循环miRNA分子的检测还具有创伤小、获取简便等优点。因此,循环miRNA分子有望成为肿瘤诊断中非侵入性的新型生物标志物。本部分实验研究的主要目的是筛选出MM患者外周血清中异常表达的miRNA分子。首先,我们随机选取初发MM患者及健康对照者各3例,利用特异性较高的Taq Man micro RNA表达谱芯片来筛选血清中异常表达的miRNA分子,结果发现有6个低表达的miRNA分子,25个高表达的miRNA分子,其中miRNA-192-5p是在MM患者血清中的表达下调尤为明显的miRNA分子。接下来,选取20例初发MM患者和20例健康体检者的血清样本,对该芯片的筛选结果进行验证,发现miRNA-192-5p在MM患者血清中的表达水平显著低于正常健康者(p0.01)。与此同时,再利用定量PCR技术,对MM细胞株LP-1细胞、正常人骨髓CD138+浆细胞中miRNA-192-5p的表达水平进行检测,结果发现,与MM患者类似,miR-192-5p在MM细胞株LP-1中的表达水平也明显低于其在正常人骨髓CD138+浆细胞的表达水平。第二部分:多发性骨髓瘤血清中miRNA-192-5p的表达量及其与MM临床参数的相关性分析已经有研究表明,循环血清中异常表达的miRNA分子与MM患者的危险分层和生存期相关。比如,循环miRNA-15a、miRNA-16-1和miRNA-17-92的表达已经被证明与MM患者的预后相关。循环miR-15a的表达水平在MM的ISS分期为II和III期的患者中比I期患者显著减少;相反,血清miR-181a和miR-181b的表达水平在ISS II和III期患者中明显增;而在总体生存期较短的患者中miR-866-5p、miR-17和miR-18a的表达较高,因此,可以根据它们的表达水平对MM患者的预后进行分层,以提高基于ISS和荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization,FISH)对MM危险分层的敏感性。本部分实验主要探讨不同疾病阶段的MM患者外周血清中miRNA-192-5p的表达水平、以及miRNA-192-5p与相关临床参数的关联性分析,目的是评估miRNA-192-5p的异常表达在MM的诊断和疾病进展、预后判断中的应用价值。首先,选取50例初发MM患者、15例完全缓解患者、15例临床复发患者以及80例健康体检者,利用荧光定量PCR技术检测上述各组MM患者及正常健康人的外周血清中miRNA-192-5p的表达水平;收集各组MM患者的血β2-微球蛋白(β2-microglobulin,β2-MG)、血钙、白蛋白、血红蛋白、血肌酐、乳酸脱氢酶、M蛋白、血轻链、尿轻链、FISH等相关临床参数,利用独立样本t检验和pearson相关等统计学方法分析血清中miRNA-192-5p的表达与上述各种临床参数的相关性。结果发现:(1)miRNA-192-5p在初发和临床复发的MM患者血清中均为显著低表达;(2)利用ROC曲线评估miRNA-192-5p对MM诊断效能,发现ROC曲线下面积为0.65,p=0.025,敏感性77%,特异性56%。(3)血β2-MG、血肌酐含量高的初发MM患者的血清miRNA-192-5p的表达水平分别低于血β2-MG、血肌酐含量低的患者。(4)血红蛋白、白蛋白含量低的初发MM患者的血清miRNA-192-5p的表达水平分别低于血红蛋白、白蛋白含量正常的患者。(5)miRNA-192-5p在初发MM患者血清中的表达水平分别与患者的血清Ig G、Ig A、κ及λ含量负相关。(6)miRNA-192-5p在有t(4;14)及13q14突变的初发MM患者血清中的表达水平显著降低。(7)进一步对50例初发MM患者进行临床追踪发现,未缓解组MM患者血清中miRNA-192-5p的表达水平明显低于缓解组MM患者。这些结果表明了miRNA-192-5p在多发性骨髓瘤的诊断中虽只能作为一个辅助诊断标准,但其在多发性骨髓瘤的疾病进展监测中可能是一个非常好的标志物。第三部分:miRNA-192-5p在多发性骨髓瘤发病机制中的作用研究表明miRNA分子在MM的发生发展过程中起着重要作用。比如,miR-21可以通过SPRY2来调控MAPK/ERK信号,介导骨髓瘤细胞的生长及耐药产生;miR-148a可通过靶向CDKN1B和PTEN来调控细胞增殖和凋亡。在前两部分的研究中,我们发现miR-192-5p在MM患者外周血清中为低表达,并且miR-192-5p的低水平与患者较重的疾病状态和较差的预后相关,但该分子在MM的发病机制中有何作用还需我们进一步的探讨。因此,本部分实验采用多发性骨髓瘤细胞株LP-1作为细胞模型,转染miR-192-5p mimic,过表达miR-192-5p,通过流式细胞术等技术,探讨miR-192-5p对MM细胞的生物学效应。结果发现:过表达miR-192-5p不仅可以诱导MM细胞的凋亡,还能明显增强目前MM的主流化疗药物硼替佐米(Bortezomib,BTZ)对MM细胞的凋亡作用。另外,过表达miRNA-192-5p还可以抑制MM细胞的增殖,而且作用时间越长、抑制效果越显著。这些结果均表明,miRNA-192-5p可以抑制MM细胞的增殖,诱导MM细胞的凋亡,增强MM主流化疗药物BTZ的治疗敏感性。在MM中miRNA-192-5p可能作为一种抑癌基因发挥作用,并有可能成为治疗MM的潜在治疗靶点。综上所述,本课题通过芯片筛选、荧光定量PCR等技术证实miR-192-5p在MM患者外周血清中低表达,并且miRNA-192-5p的异常表达可以作为MM的辅助诊断标准和监测疾病进展的标志物。过表达miR-192-5p能诱导MM细胞的凋亡,抑制细胞的增殖,与BTZ联合使用时,还可以增强其诱导细胞凋亡的作用。
[Abstract]:Multiple myeloma ( MM ) is a complicated malignant blood system disease characterized by abnormal clonal proliferation of plasma cells in bone marrow , and large amount of monoclonal immunoglobulin and fragments thereof . In order to solve these problems , it was found that miRNA - 192 - 5p can be detected in the serum of MM patients . The expression levels of miRNA - 192 - 5p , miR - 17 and miR - 18a in serum of MM patients with different stages of disease were analyzed . The correlation between miRNA - 192 - 5p and miRNA - 192 - 5p in patients with MM were analyzed . ( 5 ) The levels of miRNA - 192 - 5p were negatively correlated with the levels of serum Ig G , Ig A , kappa and 位 , respectively . It was found that miR - 192 - 5p plays an important role in the pathogenesis of MM . The results show that miR - 192 - 5p plays an important role in the pathogenesis of MM . The results show that miR - 192 - 5p plays an important role in the pathogenesis of MM .
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R733.3

【参考文献】