分别筛选与分析抗VEGF和EGFR的人重链单域抗体

发布时间：2018-06-09 11:18

  本文选题：噬菌体展示 + 人重链单域抗体　； 参考：《暨南大学》2016年博士论文

【摘要】：肿瘤在体内生长和转移均离不开血管,而血管内皮生长因子(VEGF)在血管发生和生成中起到关键的调节作用,目前已有抗VEGF的上市抗体Bevacizumab和Aflibercept用于治疗多种癌症,这说明VEGF是一个很好的用于治疗癌症的靶标。多种癌细胞能够过表达表皮生长因子受体(EGFR),EGFR的异常激活可以帮助癌细胞存活、增殖、入侵和转移,目前已经有多个抗EGFR的单克隆抗体及其抑制剂上市用于治疗多种癌症,因此EGFR也是一个很好的用于治疗癌症的靶标。虽然这些上市的抗体对于多种癌症具有一定的治疗效果,但这些抗体都是常规的单克隆抗体,这些抗体具有的分子量大,组织渗透性低,不方便进行基因工程改造,必须在真核细胞内表达等缺点。此论文的目的是想得到更好的新的抗体,经过逐步的抗体改造和完善,希望这些新的抗体能够代替这些上市的抗体。人重链单域抗体(human VH domain antibody,hd Ab)无免疫源性,分子量小,组织渗透性强,方便进行基因工程改造,具有很好的应用前景,本课题的目的是通过噬菌体展示技术分别筛选抗VEGF和EGFR的hd Ab,并对其进行初步分析,为进一步抗体改造及其用于癌症治疗打下一定的基础。此论文的第一部分是筛选和分析抗VEGF的hd Ab:(1)选择VEGF外显子3-4片段作为抗原,将其DNA克隆至表达载体,利用大肠杆菌表达,并成功地对VEGF包涵体进行蛋白纯化和复性;(2)采用噬菌体展示技术从hd Ab噬菌体文库中筛选抗VEGF的hd Ab噬菌体,经过5轮筛选,特异性结合VEGF的hd Ab噬菌体得到富集;(3)从第5轮筛选后的噬菌体中随机挑选370个噬菌体克隆,采用单克隆噬菌体ELISA检测得到41个阳性克隆;经过无关抗原的ELISA验证,得到17个特异性较高的噬菌体克隆;(4)对这17个阳性hd Ab的DNA序列测序比对,排除同样的克隆,得到4个阳性噬菌体克隆;(5)将这4个hd Ab的DNA序列进行PCR扩增,并克隆至表达载体中,在大肠杆菌中进行可溶性表达和纯化;(6)采用ELISA分别鉴定4个hdAb与VEGF之间的结合,结果发现其中有2个hd Ab与VEGF不能结合,有2个hd Ab能与VEGF结合,其中有1个hd Ab(aVE207)结合力较高;采用Western blotting进一步证实aVE207能与VEGF结合;(7)采用非竞争性ELISA检测aVE207与VEGF之间的亲和力KD值为61 nM。此论文的第二部分是筛选和分析抗EGFR的hd Ab:(1)选择EGFR domain III的氨基酸408 437片段作为抗原,并对该多肽片段进行人工合成,合成的多肽经液相色谱及质谱分析确认具有适当的纯度及大小;(2)采用噬菌体展示技术从hdAb噬菌体文库中筛选抗EGFR多肽的hd Ab噬菌体,经过5轮筛选,特异性结合EGFR多肽的hd Ab噬菌体得到富集;(3)从第5轮筛选后的噬菌体中随机挑选470个噬菌体克隆,采用单克隆噬菌体ELISA检测得到24个阳性克隆;经过无关抗原的ELISA验证,得到13个特异性较高的噬菌体克隆;(4)对这13阳性hd Ab的DNA序列测序比对,排除相同的克隆,得到5个阳性噬菌体克隆;(5)将这5个hd Ab的DNA序列进行PCR扩增,并克隆至表达载体中,在大肠杆菌中进行可溶性表达和纯化;(6)采用ELISA分别鉴定5个hd Ab与EGFR多肽之间的结合,结果发现5个hd Ab均能与EGFR多肽结合,其中有2个hd Ab(aEG3C6、aEG4C6)结合力较高,aEG3C6和aEG4C6亲和力KD值分别为62 nM和102 nM。综上所述,通过噬菌体展示技术,成功地从hd Ab噬菌体文库中筛选得到了4个抗VEGF的hd Ab噬菌体,并成功表达和纯化这4个hdAb,鉴定发现其中有1个hd Ab(aVE207)与VEGF具有较强的结合,亲和力KD值大小为61 nM。另外,还成功地从hd Ab噬菌体文库中筛选得到了5个抗EGFR的hdAb噬菌体,并成功表达和纯化这5个hd Ab,鉴定发现其中有2个hd Ab(aEG3C6、aEG4C6)与EGFR具有较强的结合,亲和力KD值大小分别为62 nM和102 nM。
[Abstract]:Human VH domain antibody ( hd Ab ) has been used to treat multiple cancers . 鎺掗櫎鍚屾牱鐨勫厠闅，

本文编号：1999547