核仁蛋白EBP2反馈调控转录因子c-Myc影响rDNA转录、细胞增殖以及肿瘤形成

发布时间：2018-06-12 04:24

本文选题：EBP2 + c-Myc　；参考：《华东师范大学》2015年博士论文

【摘要】：c-Myc是Myc蛋白家族的重要成员,它是细胞中一个非常重要的转录因子,它在细胞中有着多重的功能,调控了细胞增殖,代谢,血管新生以及DNA的修复。除此之外,c-Myc还是一个致癌蛋白,它在许多人类的癌症中都发生上调,并且能促进多种肿瘤的形成。最近的研究表明,c-Myc是一个细胞中普遍存在的转录增强因子。c-Myc在细胞中主要分布在细胞核内,通过直接与DNA结合而调控多种基因的表达。除了细胞核质的表达之外,c-Myc也在细胞质以及核仁中分布。Myc-Nick是c-Myc的一个剪切体,定位在细胞质中,调控细胞的分化。而核仁中定位的c-Myc对于核仁的生物合成起着非常重要的作用。c-Myc可以结合在核糖体DNA (rDNA)上,激活RNA聚合酶Ⅰ,进而调控rDNA的转录。c-Myc在核仁中的功能被其自身的蛋白稳定性以及它的结合蛋白严密的调控着。目前为止,SCF-Fbw7是报道的主要调控c-Myc蛋白稳定性的E3泛素连接酶。最近的研究表明,NPM对于c-Myc的核仁定位是必需的,并且NPM能通过Fbw7非依赖的方式抑制c-Myc的降解。然而调控c-Myc核仁定位以及功能的机制还需要更深入的研究。EBP2 (ENBA1 binding protein 2)最初被发现是Epstein-Bair病毒(EBV)核抗原1的结合蛋白,在EBV的分裂中非常重要。酵母中的EBP2同源蛋白在前核糖体RNA(pre-rRNA)的剪切和核糖体亚单元组装中非常重要。在哺乳细胞中,EBP2与nucleostemin结合并定位在核仁中。除此之外,人体细胞中EBP2在有丝分裂时能与染色体结合。在293细胞和NIH3T3细胞中过表达EBP2被发现与细胞增殖和染色体不稳定有关系。最近的报道证明EBP2对于Fbw7γ在核仁中的定位非常重要。然而EBP2在哺乳动物中的功能并不清楚。在本研究中,我们发现EBP2是一个全新的c-Myc结合蛋白。我们分别通过免疫荧光的实验发现过表达EBP2能明显的促进c-Myc的细胞核仁的定位,而如果将EBP2沉默则会导致c-Myc核仁定位的缺失。同时,我们还利用亚细胞结构分离的方法验证了这一结果。由于c-Myc的核仁定位会被其共结合蛋白调控,我们推测c-Myc能与EBP2发生直接的相互作用。我们利用免疫共沉淀的方法证明了c-Myc与EBP2蛋白确实可以发生直接的相互作用,并且内源的免疫共沉淀也表明内源的c-Myc蛋白与EBP2蛋白也是相互作用的。同时,体外pull down的实验证明了c-Myc蛋白与EBP2蛋白的相互作用是直接的。并且我们构建了一些列c-Myc和EBP2的截短型缺失突变的质粒,通过免疫共沉淀的方法找到了c-Myc与EBP2相互作用的具体结构域—EBP2蛋白的氮末端介导了其与c-Myc的相互作用,而c-Myc蛋白的氮末端与碳末端对于介导其与EBP2的相互作用都非常重要,并且免疫荧光的实验也进一步验证了这一结果。接着,我们进一步的实验发现过表达EBP2还能从蛋白水平稳定c-Myc。表达剂量增加的EBP2会导致c-Myc蛋白的含量随着EBP2表达的增加而增加,并且过表达EBP2会增加c-Myc蛋白的半衰期。相反的,如果沉默EBP2会导致c-Myc蛋白表达量的减少,并且明显缩短了c-Myc蛋白的半衰期。进一步我们发现EBP2稳定c-Myc蛋白是通过Fbw7非依赖的方式。同时,在实验中我们还发现过表达c-Myc也能增加EBP2的蛋白水平。我们证明了c-Myc促进EBP2蛋白水平增加是通过调控EBP2的转录来实现的。染色质免疫共沉淀的实验证明了c-Myc可以结合在EBP2启动子区域的E-box区域。并且荧光素酶报告基因的实验也表明c-Myc确实可以通过结合EBP2的启动子区域促进EBP2的转录,而如果将EBP2启动子区域E-box区域突变为c-Myc不能结合的序列,则c-Myc就不能促进其转录。由此,EBP2能促进c-Myc的核仁定位并稳定其蛋白水平,而c-Myc又通过一种正反馈调控的形式促进EBP2的转录。功能上,EBP2在肺癌细胞系中高表达。并且过表达EBP2能促进肺癌细胞的增殖,以及肺癌细胞在裸鼠中的成瘤能力。同时我们在人肺癌和癌旁组织的中检测了c-Myc和EBP2的表达,发现EBP2在人肺癌组织中同样高表达,并且这种表达量的上调与c-Myc的表达量上调成很好的正相关。由此,我们发现EBP2是一种潜在的癌基因,在肺癌中高表达,并促进肺癌细胞的增殖。并且我们发现EBP2是通过促进c-Myc激活的rDNA的转录而促进c-Myc介导的肺癌细胞的增殖。
[Abstract]:c - Myc is a very important transcription factor in the cell and regulates cell proliferation , metabolism , angiogenesis and DNA repair . EBP2 can promote the localization of c - Myc and stabilize its protein level , while c - Myc promotes the transcription of EBP2 in the form of positive feedback . The expression of c - Myc and EBP2 in human lung cancer cells is also detected by overexpression of EBP2 .
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R73-3

【相似文献】