S100A8通过调控炎性微环境中的巨噬细胞促进结直肠癌细胞迁移及其分子机制

发布时间：2018-06-14 12:47

本文选题：S100A8 + miR-155　；参考：《重庆医科大学》2016年博士论文

【摘要】：研究目的结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是世界性常见的恶性消化道肿瘤,也是我国常见八大癌症之一,其发病率年平均增长约4.2%,高于全球平均增长速度。随着病情的发展,其肿瘤组织可逐渐突破肠壁,进而侵袭腹腔、卵巢等邻近组织器官,甚至转移至肝脏和肺等远端组织器官。可见CRC已成为当今我国面临的重大卫生健康问题。研究CRC发生发展机制以提高对CRC的早期诊断及防治水平,成为我国医疗卫生体系亟待解决的重要科学问题。慢性炎症和致癌物是两大重要的致癌因素,其中“促进肿瘤的炎症”在2011年被著名癌症学者Hanahan和Weinberg正式列为癌症的十大特征之一。此外,已有的流行病学和分子生物学研究表明:炎症和CRC的发生发展存在着密切联系,认为CRC属于炎症相关性肿瘤。尽管如今炎症与CRC的关系已经基本明确,但是炎症促进CRC发生发展的具体作用方式和分子机制的仍然有待进一步研究。“肿瘤微环境”这一概念的提出和对其理解的深入,为阐明炎症和肿瘤之间的关系开启了一个新视野。作为肿瘤微环境的重要组分的巨噬细胞受肿瘤微环境的影响,其表型及功能可能会发生相应改变,进而影响肿瘤的发生发展。据报道,与正常人群相比,CRC患者结直肠组织中存在更多浸润的巨噬细胞,而且病变程度越严重,浸润的巨噬细胞越多。可见,巨噬细胞浸润与crc关系密切。此外,研究表明由于crc组织肠黏膜通透性改变和细菌移位,肠上皮表面均暴露于富含细菌脂多糖(lipopolysaccharide,lps)的炎性环境中。因此,研究肿瘤微环境中巨噬细胞与crc的相互关系时,lps常被用于模拟还原crc炎性微环境。s100a8(又称mrp8,calgranulina)这一重要的炎性分子是s100蛋白家族成员之一。geneontology生物信息学分析显示s100a8参与急、慢性炎症反应、趋化反应、lps诱导反应等生物学过程。有报道称s100a8在多种肿瘤细胞和癌周浸润的炎性细胞中可见到其水平增高,并且与肿瘤的分期、分化、血管生成或预后等具有相关性。同时,s100a8既能在特定条件下刺激炎症细胞释放炎性因子,直接参与炎症疾病过程,又能通过活化toll样受体4(tolllikereceptors4,tlr4)激活巨噬细胞的fcγ受体表达,在慢性关节炎中发挥重要作用。有研究表明tlr4是s100a8调控巨噬细胞的关键受体,而nf-κb信号通路是tlr4下游的重要信号级联通路,在炎症反应中发挥重要的作用。mir-155是一个典型的多功能mirna,参与炎症、免疫反应和肿瘤等多种病理生理过程;其异常表达与nf-κb信号通路的激活密切相关;高表达的mir-155可以促进免疫细胞分泌多种炎性因子,放大炎症效应,加剧组织损伤、癌前病变和肿瘤形成。那么,作为炎性微环境中的重要一员的s100a8是否参与调控炎性微环境中的巨噬细胞?其具体机制如何?s100a8对炎性微环境中巨噬细胞的调控作用对crc的进展又有什么作用呢?基于此,本研究拟通过lps模拟crc所处的炎性微环境,以炎性微环境中的巨噬细胞(本论文中,我们称之为“炎性肿瘤相关巨噬细胞”,inflammatorytumorassociatedmacrophages,itams)为调控对象,探讨s100a8对itams的调控作用和由此调控作用介导的对crc细胞的活力和迁移的影响及潜在的分子机制。为阐明s100a8在crc进程中的作用和炎症促进crc发生发展的机制积累实验依据,为预防和治疗crc提供新策略和新的干预靶点。方法1s100a8对itams的调控作用及其分子机制1.1重组蛋白gst-hs100a8及对照gst蛋白的制备将重组质粒pgst-moluc-s100a8和pgst-moluc化学法转化感受态细胞bl21中;加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)诱导重组蛋白的表达;收集菌液,超声破菌,再用谷胱甘肽-琼脂糖4b球珠(glutathionesepharose4bbeads,gs4bb)分离纯化重组蛋白,最后经过滤菌器除菌后分装保存于-80℃。1.2体外诱导thp-1细胞分化为巨噬细胞常规培养悬浮生长的thp-1细胞,用不同终浓度pma诱导其分化为巨噬细胞;通过观察、比较不同浓度pma对细胞形态及生存能力的影响,选择最适诱导浓度。加入lps处理诱导分化成功的巨噬细胞,即为炎性肿瘤相关巨噬细胞(itams)。1.3mtt法检测lps及重组蛋白gst-hs100a8对巨噬细胞生存能力的影响常规培养thp-1细胞,调整细胞密度为4×104/ml,加入适当浓度的pma后接种于96孔板中,每组设3~5个复孔,每孔100μl。24h后,除去旧培养基并用pbs清洗3次(除去pma)再进行干预。设置lps(0-400ng/ml)和gst-hs100a8(0-40μg/ml)各5个浓度梯度,37℃、5%co2的饱和湿度箱中继续培养和观察。每隔24h进行一次mtt检测,重复三次,为后续实验选择最适干预浓度。1.4s100a8对itams的调控作用1)real-timepcr检测s100a8处理itams后mir-155表达量的变化经gst-hs100a8蛋白处理itams后,收集相应处理时间段的细胞,提取总rna后,通过特异性引物逆转录为cdna,再进行real-timepcr,检测各组细胞中的mir-155水平。2)rt-pcr检测s100a8处理itams后炎性因子il-1β和tnf-α的mrna表达量的变化经gst-hs100a8蛋白处理itams后,收集相应处理时间点(6-48h)的细胞,提取总rna后,通过随机引物逆转录为cdna后进行touchdownpcr,检测各组细胞中il-1β和tnf-α的mrna水平。3)elisa检测s100a8处理itams后培养上清中炎性因子il-1β和tnf-α表达量的变化经gst-hs100a8蛋白处理itams24h后,收集培养基,离心取上清,采用elisa方法检测相应处理组上清中il-1β和tnf-α水平的变化。1.5s100a8调控itams的分子机制1)免疫荧光法检测s100a8处理itams后tlr4的表达和nf-κb的分布变化(即是否发生核移位)将itams接种于无菌的细胞爬片上,经gst-hs100a8及对照gst蛋白处理一定时间后,采用免疫荧光检测细胞tlr4的表达和nf-κb的分布变化。2)westernbolt检测s100a8处理后itams中nf-κb的分布变化经gst-hs100a8及对照gst蛋白处理itams,于不同时间点收集细胞,或nf-κb信号通路抑制剂bay11-7082预处理itams30min,再加入gst-hs100a8处理1h,提取总蛋白和胞核蛋白,采用westernbolt法检测s100a8处理的itams中nf-κb的分布变化。3)荧光素酶活性检测s100a8处理后itams中转录因子nf-κb活性变化将信号通路质粒pnf-κb-luc转染itams,经gst-hs100a8蛋白处理24h后或bay11-7082预处理30min,再经gst-hs100a8蛋白处理24h,检测荧光素酶活性的变化。4)探讨s100a8处理的itams中nf-κb、mir-155和炎性因子(il-1β和tnf-α)的相互关系(1)s100a8促进itams中mir-155表达是否涉及nf-κb信号通路的激活:bay11-7082预处理itams30min,再经gst-hs100a8蛋白处理24h,real-timepcr检测细胞中mir-155的表达水平。(2)s100a8促进itams中炎性因子il-1β和tnf-α表达是否涉及nf-κb信号通路的激活:bay11-7082预处理itams30min,再经gst-hs100a8蛋白处理24h后,rt-pcr和elisa检测细胞中il-1β和tnf-αmrna表达情况及分泌il-1β和tnf-α的水平。(3)s100a8促进itams中炎性因子il-1β和tnf-α表达是否涉及mir-155的高表达:转染mir-155inhibitor及对照mir-155nc入itams中,再经gst-hs100a8蛋白处理24h后,real-timepcr检测细胞中mir-155的表达水平;rt-pcr和elisa检测细胞中il-1β和tnf-αmrna表达情况及分泌il-1β和tnf-α的水平。2s100a8调控itams而介导的对crc细胞的活力和迁移的影响及其分子机制2.1制备itams条件培养基(itams-cm):将itams接种培养于100mm的细胞培养皿上,更换无血清(或1%血清)培养基,经gst-hs100a8蛋白处理24h后,收集培养基,离心,其上清即为itams-cm;分装后保存于4℃冰箱中备用(2周内使用)。2.2探讨s100a8调控itams而介导的对crc细胞活力的影响(1)mtt法检测itams-cm对crc细胞增殖能力的影响;(2)将itams和crc细胞共培养,经gst-hs100a8蛋白处理24h后,流式细胞术检测crc细胞的细胞周期变化;(3)将itams和crc细胞共培养,经gst-hs100a8蛋白处理24h后,hoechest33258免疫荧光检测crc细胞的凋亡水平。2.3s100a8调控itams而介导的对crc细胞迁移能力的影响将对数生长期的crc细胞均匀接种于六孔板或者transwell共培养小室中与itams共培养,加入gst-hs100a8蛋白处理或者bay11-7082预处理30min后再加入gst-hs100a8蛋白,通过划痕愈合试验和transwell试验检测crc细胞的迁移能力变化。结果1s100a8对itams的调控作用及其分子机制1.1gst-hs100a8和对照gst重组蛋白的鉴定所制备的重组蛋白gst-hs100a8和对照gst经sds-page电泳和考马斯亮蓝染色及westernblot鉴定,提示重组蛋白制备成功,其纯度均大于90%,可用于后续实验。1.2体外诱导thp-1细胞分化为巨噬细胞thp-1细胞经不同浓度(0、25、50、100、200和400ng/ml)pma诱导24h后细胞停止增殖,大部分细胞从悬浮状态转变为贴壁生长,并且部分细胞生出伪足,即分化为成熟的巨噬细胞。其中,50ng/ml的pma处理后的诱导效果最为显著,因此后续实验均选择50ng/ml的pma作为诱导剂。1.3lps及s100a8对巨噬细胞生存能力的影响0、50、100、200和400ng/ml的lps对分化成熟的巨噬细胞的生存能力无明显影响(p0.05)。后续实验选择100ng/ml处理巨噬细胞,即为炎性肿瘤相关巨噬细胞(itams),作为后续实验的细胞模型。此外,0、5、10、20和40μg/ml的gst-hs100a8蛋白处理巨噬细胞后,对其生存能力也无明显影响(p0.05)。1.4s100a8对itams的调控作用1)s100a8促进itams中mir-155的表达real-timepcr检测发现,gst-hs100a8蛋白能显著促进itams中mir-155的表达,并且在10μg/ml处理组中mir-155的表达最高(p0.05)。因此,后续实验均选择10μg/ml的gst-hs100a8蛋白处理itams。同时,gst-hs100a8蛋白处理itams6h、12h、24h和48h后,mir-155表达水平随着处理时间的延长而升高,具有时间依赖性。2)s100a8促进itams中炎性因子il-1β和tnf-α的表达rt-pcr检测发现,gst-hs100a8处理后的itams中il-1β和tnf-αmrna的水平明显高于对照组(p0.05),并且在处理时间为24h时表达量最高。elisa检测结果显示,gst-hs100a8蛋白处理的itams培养上清中il-1β和tnf-α的水平明显高于对照组(p0.01)。以上结果表明,gst-hs100a8蛋白可以上调itams中mir-155、炎性因子il-1β和tnf-α的表达。1.5s100a8调控itams的分子机制1)s100a8促进itams中tlr4的表达免疫荧光法发现lps或gst-hs100a8单独处理巨噬细胞24h后,膜受体tlr4表达水平高于空白对照组;lps和gst-hs100a8共同处理巨噬细胞后,tlr4的表达水平高于其他处理组,提示s100a8可以促进itams中tlr4的表达。2)s100a8促进itamsnf-κb核移位免疫荧光法发现gst-hs100a8处理itams后,p-nf-κbp65核移位程度与其他处理组相比显著增强(p0.05),并且处理1h后核移位水平达到峰值(p0.05)。westernblotanalysis检测结果与免疫荧光法的结果一致,gst-hs100a8处理itams1h后,胞核中p-nf-κbp65水平明显高于其他处理组(p0.05),但是细胞中总p-nf-κbp65的水平并无显著差异(p0.05)。此外,gst-hs100a8处理itams不同时间后细胞核中p-nf-κbp65水平均有所升高,但无明显的时间依赖性,总p-nf-κbp65水平也无明显变化(p0.05)。但是当加入bay11-7082预处理30min,gst-hs100a8上调itams细胞核中p-nf-κbp65的水平被部分抑制(p0.05),提示bay11-7082可以部分抑制s100a8激活nf-κb信号通路。荧光素酶活性检测发现gst-hs100a8处理itams24h后,培养上清中荧光素酶活性明显高于其他处理组(p0.05),但是当加入bay11-7082预处理30min后,荧光素酶活性被明显抑制(p0.05),提示gst-hs100a8可以增强itams中nf-κb转录因子的活性。3)s100a8通过激活nf-κb信号通路上调itams中mir-155的表达real-timepcr检测发现,当加入bay11-7082预处理30min后,gst-hs100a8上调itams中mir-155表达的能力也被明显抑制(p0.05),提示s100a8上调itams中mir-155的表达是通过激活nf-κb信号通路实现的。4)s100a8上调itams中mir-155促进炎性因子il-1β和tnf-α的表达real-timepcr检测发现,当itams转染mir-155inhibitor后,gst-hs100a8上调itams表达mir-155的能力被明显抑制(p0.05),提示mir-155inhibitor可以下调s100a8处理后的itams中mir-155的表达;rt-pcr结果显示,当转染mir-155inhibitor或bay11-7082预处理30min后,gst-hs100a8促进itams表达il-1β和tnf-αmrna的作用受到抑制(p0.05);转染mir-155inhibitor或bay11-7082预处理30min后,gst-hs100a8促进itams分泌il-1β和tnf-α的作用受到明显抑制(p0.05)。上述结果一致提示s100a8通过激活nf-κb信号通路和上调itams中mir-155促进炎性因子il-1β和tnf-α的表达。2s100a8调控巨噬细胞而介导的对crc细胞活力和迁移的影响及其分子机制2.1s100a8通过调控itams而介导的对crc细胞活力的影响1)s100a8通过调控itams而介导的对crc细胞增殖能力的影响gst-hs100a8处理itams24h后制备的itams-cm对hct116和sw480细胞的增殖能力无明显影响(p0.05)。2)s100a8通过调控itams而介导的对crc细胞的细胞周期的影响gst-hs100a8处理的itams和crc细胞共培养24h后,hct116细胞的细胞周期无明显改变(p0.05)。3)s100a8通过调控itams而介导的对crc细胞凋亡的影响gst-hs100a8处理的itams和crc细胞共培养24h后,hct116细胞的凋亡水平无明显变化(p0.05)。2.2s100a8通过调控itams而介导的对crc细胞迁移能力的影响及其分子机制划痕愈合试验发现,gst-hs100a8处理的itams后与hct116和sw480细胞共培养72h后,crc细胞迁移能力与其他处理组相比显著增强(p0.05);而经bay11-7082预处理30min后,gst-hs100a8的促迁移能力受到明显抑制(p0.05)。transwell试验发现,gst-hs100a8处理itams后与crc细胞共培养24h后,穿过微孔膜的细胞数量与其他处理组相比明显升高(p0.05);而经bay11-7082预处理30min后,gst-hs100a8的促迁移能力也受到明显抑制(p0.05)。这两个试验一致提示s100a8调控itams的效应能明显促进crc细胞的迁移,其中nf-κb信号通路激活是关键。结论(1)s100a8能显著促进itams高表达mir-155和炎性因子il-1β和tnf-α,此即s100a8调控itams的效应。(2)TLR4/NF-κB/miR-155信号通路的激活参与介导S100A8调控iTAMs的效应。(3)S100A8调控iTAMs的效应能明显促进CRC细胞的迁移,但对其活力无明显影响。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.3

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