柚皮素对人胃癌SGC7901细胞的影响及其相关机制研究
发布时间：2018-06-14 13:54
本文选题：胃癌 + 柚皮素 ； 参考：《河北医科大学》2016年博士论文
【摘要】：胃癌(gastric cancer,GC)是世界上癌症致死的第二大因素,在中国GC患者的死亡数量占所有癌症患者死亡数量的约23㳠。作为一种高度恶性的肿瘤,GC具有无限制性细胞增殖、侵袭、转移等特性。和其它恶性肿瘤一样,GC的发生发展是一个复杂的过程。首先,癌细胞无限制性生长;然后癌细胞自原发肿瘤脱落并侵袭至周围组织或进入血管和淋巴管;最终,癌细胞停留并定居在靶器官并形成转移肿瘤。大多数的GC病人在确诊时已进入晚期,尽管放化疗已用于治疗GC,但GC的预后仍不乐观。中药取材方便、价廉、毒副作用小,故中药及其有效成分抗肿瘤的机制研究已成为当今医学研究的热点。柚皮素(naringenin,Nar),自柑橘类水果中提取,属于二氢黄酮类化合物。它的生物活性广泛,包括:抗癌基因活性、抗动脉粥样硬化活性、抗炎作用、抗氧化作用等。和其它黄酮类化合物一样,Nar可以通过一系列作用机制抑制癌细胞的生长,例如:破坏口腔鳞状细胞癌的细胞周期进程,抑制人K562细胞白血病的细胞增殖。另有报道显示,Nar可以抑制癌细胞的迁移、转移和组织侵袭。有研究证实,Nar对几种典型的癌症具有有效的抗癌作用,例如:膀胱癌、肝癌、乳腺癌和结肠癌。Nar的器官特异性癌症化疗作用和疗效已被公认并且Nar被认为是癌症的一种化疗或治疗药物。而且,Nar对GC的初步抗癌活性也已被证实。近几年的研究显示Nar不仅可以抑制GC中的beta-catenin/Tcf信号通路,还可以上调GC诱导大鼠的氧化还原状态从而降低患癌的风险。然而,Nar对GC发展转移的影响及其作用机制仍有待阐明。基于上述研究,为了进一步了解Nar对GC是否具有治疗作用,我们研究了:(1)Nar对人胃癌SGC7901细胞生长、增殖的影响。(2)Nar对人胃癌SGC7901细胞迁移和侵袭的影响。(3)Nar对人胃癌SGC7901细胞凋亡的影响。(4)Nar对人胃癌SGC7901细胞AKT信号通路的影响。最终阐明了Nar可以明显抑制人胃癌SGC7901细胞的增殖、迁移和侵袭,并诱导细胞凋亡。这些作用与AKT的磷酸化抑制和下游靶因子的表达有关。为其进一步的临床应用提供实验及理论依据。第一部分nar对人胃癌sgc7901细胞生长、增殖的影响目的:研究nar对人胃癌sgc7901细胞生长、增殖的影响,明确nar对人胃癌sgc7901细胞生长、增殖是否具有抑制作用。方法:sgc7901细胞为人gc细胞,购买于上海生命科学细胞资源中心,并将细胞在rpmi1640培养基中进行培养。培养基中含有:10%胎牛血清、100units/ml青霉素、100mg/ml链霉素。培养箱的co2浓度维持在5%,温度维持在37℃。浓度为0.25%的胰酶(含有0.02%edta)用于细胞传代,每周2~3次。采用四甲基噻唑蓝法(methylthiazolyltetrazolium,mtt)研究nar对人胃癌sgc7901细胞生长率的影响。将sgc7901细胞以每孔1×104个细胞的密度接种在96孔板中并孵育24h,每种处理方式设6个复孔。用不同浓度(0、5、10、20、40、80、160μmol/l)的nar处理sgc7901细胞48h,另外用40μmol/l的nar处理sgc7901细胞0、24、48和72h,观察sgc7901细胞生长率的变化。采用western-blot法检测人胃癌sgc7901细胞增殖细胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen,pcna)蛋白的表达变化。用浓度为0、20、40、80μmol/l的nar处理sgc7901细胞48h后收集细胞,用于实验。观察人胃癌sgc7901细胞增殖活性的变化。结果:1mtt结果显示:nar浓度为5μmol/l时,sgc7901细胞的生长率没有明显的改变。但是,浓度为10、20、40、80和160μmol/l时,nar对sgc7901细胞的生长率起剂量依赖性抑制作用(p0.05);同时,nar浓度为40μmol/l,分别处理sgc7901细胞0、24、48和72h时,nar对sgc7901细胞的生长率起时间依赖性抑制作用(p0.05)。2western-blot结果显示:nar浓度为0、20、40和80μmol/l时,nar对sgc7901细胞pcna蛋白表达起剂量依赖性抑制作用(p0.05)。结论:nar呈剂量、时间依赖性的抑制人胃癌sgc7901细胞的生长、增殖。第二部分nar对人胃癌sgc7901细胞迁移和侵袭的影响目的:研究nar对人胃癌sgc7901细胞迁移和侵袭的影响,进而探讨nar对人胃癌sgc7901细胞迁移和侵袭的作用及其可能的作用机制。方法:细胞培养方法同第一部分。细胞划痕实验用于检测nar对人胃癌sgc7901细胞迁移的影响。sgc7901细胞以每孔5×104个细胞的密度接种在12孔培养板内,生长至80~90%融合后用于实验。用200μl枪头将单层细胞划痕后用pbs冲洗两遍,然后用浓度为0、20、40、80μmol/l的nar处理sgc7901细胞48h,另外用40μmol/l的nar处理sgc7901细胞24、48和72h,观察sgc7901细胞迁移活性的变化。细胞迁移活性用迁移至划痕处的细胞数量来表示。transwell小室法用于检测nar对人胃癌sgc7901细胞侵袭活性的影响。用浓度为0、20、40、80μmol/l的nar处理sgc7901细胞48h,另外用40μmol/l的nar处理sgc7901细胞24,48和72h,观察sgc7901细胞侵袭活性的变化。实时定量rt-pcr和western-blot用于检测人胃癌sgc7901细胞基质金属蛋白酶(mmp2和mmp9)及其抑制剂(timp1和timp2)的mrna和蛋白的表达变化。用浓度为0、20、40、80μmol/l的nar处理sgc7901细胞48h后收集细胞,用于实验。结果:1细胞划痕实验结果显示:nar浓度为0、20、40和80μmol/l时,nar对sgc7901细胞的迁移活性起剂量依赖性抑制作用(p0.05);同时,nar浓度为40μmol/l,分别处理sgc7901细胞24,48和72h时,sgc7901细胞的迁移活性与对照组比较明显下降(p0.05)。2transwell小室实验结果显示:nar浓度为0、20、40和80μmol/l时,nar对sgc7901细胞的侵袭活性起剂量依赖性抑制作用(p0.01);同时,nar浓度为40μmol/l,分别处理sgc7901细胞24、48和72h时,sgc7901细胞的迁移活性与对照组比较明显下降(p0.01)。3实时定量rt-pcr和western-blot结果显示:nar浓度为0、20、40和80μmol/l时,nar对sgc7901细胞mmp2和mmp9的mrna和蛋白表达呈剂量依赖性抑制作用(p0.05),但对timp1和timp2表达没有明显影响。结论:nar可以抑制人胃癌sgc7901细胞的迁移和侵袭活性,并且降低mmp2和mmp9的表达。表明nar可能通过降低mmp2和mmp9的表达对人胃癌sgc7901细胞的迁移和侵袭发挥抑制性调节作用。第三部分nar对人胃癌sgc7901细胞凋亡的影响目的:研究nar对人胃癌sgc7901细胞凋亡的影响,进而探讨nar对人胃癌sgc7901细胞凋亡作用及其可能的作用机制。方法:细胞培养方法同第一部分。流式细胞术用于检测人胃癌sgc7901细胞的凋亡率。用浓度为0、20、40和80μmol/l的nar处理sgc7901细胞48h,另外用40μmol/l的nar处理sgc7901细胞24、48和72h后,用annexinv-fitc孵育细胞,然后用流式细胞仪检测细胞凋亡率。实时定量rt-pcr和western-blot用于检测人胃癌sgc7901细胞凋亡相关因子bax、bcl-2、survivin和cleaved-caspase-3的mrna和蛋白的表达变化。用浓度20、40和80μmol/l的nar处理sgc7901细胞48h后收集细胞,用于实验。结果:1流式细胞术结果显示:nar浓度为0、20、40和80μmol/l时,nar对sgc7901细胞的凋亡率起剂量依赖性促进作用(p0.05);同时,nar浓度为40μmol/l,分别处理sgc7901细胞24、48和72h时,sgc7901细胞凋亡率与对照组比较明显增加(p0.05)。2实时定量rt-pcr和western-blot结果显示:nar浓度为20、40和80μmol/l时,sgc7901细胞的促凋亡因子bax和cleaved-caspase-3的mrna和蛋白表达明显增加(p0.05),而抑制凋亡的bcl-2和survivin的mrna和蛋白表达明显减少(p0.05)。结论:nar以剂量和时间依赖性促进人胃癌sgc7901细胞的凋亡。nar通过增加sgc7901细胞的促凋亡因子bax和cleaved-caspase-3的mrna和蛋白表达,减少抑制凋亡因子bcl-2和survivin的mrna和蛋白表达而起到促进sgc7901细胞的凋亡作用。第四部分nar对人胃癌sgc7901细胞akt信号通路的影响目的:研究nar对人胃癌sgc7901细胞akt信号通路的影响,进而探讨nar是否通过下调akt信号通路抑制人胃癌sgc7901细胞的增殖、迁移和侵袭并促进细胞凋亡。方法:细胞培养方法同第一部分。首先,分别用浓度为0、20、40和80μmol/l的nar对sgc7901细胞进行处理,时间为24、48和72h;然后收集细胞进行western-blot检测。检测指标为:akt和p-akt(磷酸化akt)。然后,将细胞分为四组:1组,不用任何试剂处理;2组,用浓度为50μmol/l的ly294002(akt抑制剂)处理sgc7901细胞2h;3组,浓度为40μmol/l的nar处理sgc7901细胞48h;4组,首先用浓度为50μmol/l的ly294002处理sgc7901细胞2h,然后用浓度为40μmol/l的nar处理sgc7901细胞48h。最后,用mtt检测细胞的生长率;用划痕实验和transwell小室检测法检测细胞的迁移和侵袭活性;用流式细胞术检测细胞的凋亡情况;用western-blot检测上述活性相关因子和akt信号通路的蛋白表达情况,检测指标为:pcna、bax、bcl-2、mmp2、mmp9、timp1、timp2、akt和p-akt。结果:1nar对人胃癌sgc7901细胞akt蛋白表达和磷酸化的影响。western-blot研究结果显示:nar以剂量和时间依赖方式抑制sgc7901细胞akt的磷酸化,但akt蛋白表达没有明显的变化。2nar和akt抑制剂ly294002对人胃癌sgc7901细胞生长的影响。mtt研究结果显示:nar和ly294002均能降低sgc7901细胞的生长率(p0.01),并且两种药物共同作用于细胞时会进一步降低sgc7901细胞的生长率(p0.01)。3nar和akt抑制剂ly294002对人胃癌sgc7901细胞迁移和侵袭的影响。细胞划痕实验结果显示:nar和ly294002均能降低sgc7901细胞的迁移活性(p0.01),并且两种药物共同作用于细胞时会进一步降低sgc7901细胞的迁移活性(p0.01)。transwell小室实验结果显示:nar和ly294002均能降低sgc7901细胞的侵袭活性(p0.01),并且两种药物共同作用于细胞时会进一步降低sgc7901细胞的侵袭活性(p0.01)。4nar和akt抑制剂ly294002对人胃癌sgc7901细胞凋亡的影响。流式细胞术结果显示:nar和ly294002均能促进sgc7901细胞凋亡(p0.01),并且两种药物共同作用于细胞时会进一步促进sgc7901细胞的凋亡(p0.01)。5 Nar和AKT抑制剂LY294002对人胃癌SGC7901细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡相关因子及AKT蛋白表达和磷酸化的作用。为了进一步确认Nar与AKT抑制剂LY294002联合使用对人胃癌SGC7901细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡及AKT蛋白表达和磷酸化的作用机制,采用Western-blot方法检测了PCNA、Bax、Bcl-2、MMP2、MMP9、TIMP1、TIMP2、AKT和p-AKT的表达变化。Western-blot研究结果显示:Nar和LY294002均能增加SGC7901细胞Bax的表达(P0.05),并且两种药物共同作用于SGC7901细胞时会进一步增加其表达(P0.05,);Nar和LY294002均能降低SGC7901细胞PCNA、Bcl-2、MMP2、MMP9、p-AKT的表达(P0.05),并且两种药物共同作用于细胞时会进一步降低其的表达(P0.05);但是,Nar和LY294002对SGC7901细胞AKT、TIMP1、TIMP2的表达均没有明显影响。结论:Nar可以抑制人胃癌SGC7901细胞AKT的磷酸化,Nar和LY294002联合用药可以协同作用进一步抑制SGC7901细胞AKT的磷酸化。Nar可能是通过抑制AKT的磷酸化,下调AKT信号通路,抑制人胃癌SGC7901细胞的增殖、迁移和侵袭并促进细胞凋亡。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.2
【参考文献】
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，本文编号：2017623
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