相关成纤维细胞自噬调控对乳腺癌MCF-7细胞上皮间质转化影响

发布时间：2018-06-18 02:54

  本文选题：乳腺癌 + CAFs　； 参考：《中华肿瘤防治杂志》2017年09期

【摘要】：目的研究报道,乳腺癌相关成纤维细胞(cancer associated fibroblasts,CAFs)在乳腺癌的侵袭、转移中起到促进作用,而机制未明。本研究探讨乳腺癌CAFs自噬调控对MCF-7细胞EMT进程的影响。方法采用胶原酶消化法对CAFs及配对人乳腺癌正常成纤维细胞(NBFs)进行原代培养,采用免疫荧光和蛋白质印迹法进行鉴定;建立CAFs和NBFs与MCF-7条件培养基(CM)共培养及Transwell小室共培养模型,共分为3组进行实验,空白组即MCF-7单独培养组(CON),对照组即正常乳腺癌成纤维细胞与MCF-7共培组(NBFs),实验组即乳腺癌相关成纤维细胞与MCF-7共培养组(CAFs)。Transwell侵袭及迁移实验检测各组MCF-7细胞侵袭和迁移能力。蛋白印迹法检测各组MCF-7细胞EMT上皮标志分子E-cadherin蛋白和间质标志分子N-cadherin和Vimentin蛋白表达情况;蛋白质印迹法检测CAFs与NBFs自噬相关蛋白LC3B、Beclin1和p62表达差异;自噬抑制剂3MA处理CAFs后蛋白质印迹法检测CAFs上述自噬相关蛋白表达差异;予以自噬抑制剂3MA预处理CAFs后,收集CM与MCF-7共培养,分3组进行实验,空白组即MCF-7单独培养组(CON);对照组即MCF-7与CAFs-CM共培养组(CAFs-CM);实验组即MCF-7与3MA-CAFs-CM共培养组(3MA-CAFs-CM)。蛋白质印迹法检测各组MCF-7细胞EMT上皮标志分子E-cadherin蛋白和间质标志分子N-cadherin和Vimentin蛋白表达情况。结果通过酶消化法原代培养可获取α-SMA(+)、Vimentin(+)E-cadherin(-)具有CAFs典型特征的肌成纤维细胞;Transwell侵袭、迁移实验证实CAFs可促进MCF-7细胞侵袭、迁移;蛋白质印迹法检测显示,CAFs组MCF-7E-cadherin蛋白表达量为0.432±0.012,比NBFs组的0.585±0.02及空白组的0.659±0.016表达水平低,F=120.098,P0.05。而CAFs组间质蛋白标志物Vimentin蛋白表达量为0.309±0.065,比NBFs组的0.103±0.011及空白组的0.062±0.009表达低,F=42.395,P均0.05。CAFs组N-cadherin蛋白表达量为1.439±0.07比BNFs组的1.3347±0.028及空白组的1.176±0.021表达低,F=22.578,P0.05,提示CAFs促进MCF-7发生EMT;CAFs细胞的Beclin1蛋白表达量为2.950±1.261,高于NBFs的0.862±0.727,t=-3.21,P0.05;CAFs细胞的LC3BⅡ/LC3BⅠ灰度值比值为2.937±0.194,高于NBFs的2.314±0.224,t=-3.638,P0.05;而CAFs p62蛋白表达量为0.342±0.093,低于NBFs的0.750±0.021,t=7.432,P0.05,提示CAFs自噬水平高于NBFs。予以自噬抑制剂3MA处理CAFs后,处理组CAFs细胞的Beclin1蛋白表达量为0.211±0.008,低于未处理组的0.266±0.009,t=8.094,P0.05;处理组CAFs细胞的LC3BⅡ/LC3BⅠ灰度值比值为0.496±0.004,低于未处理组的0.618±0.022,t=9.312,P0.05;而处理组的p62蛋白表达量为0.307±0.043,高于未处理组的0.143±0.008,t=-6.471,P0.05,说明3MA可以抑制CAFs自噬水平。自噬调控后共培养,各组E-cadherin蛋白表达有统计学意义,F=44.157,P0.05;与对照组MCF-7细胞E-cadherin蛋白表达量1.209±0.010相比,CAFs-CM组的1.062±0.027表达下调,而3MA-CAFs-CM组MCF-7细胞E-cadherin蛋白表达量为1.104±0.019,较CAFs-CM组表达上调,均P0.05;3组MCF-7细胞Vimentin和N-cadherin表达差异有统计学意义,P0.05。结论 CAFs能够促进MCF-7发生EMT并增强其侵袭转移能力,而抑制CAFs自噬后,其诱导的MCF-7发生EMT进程受到抑制。
[Abstract]:Objective to study the effect of cancer associated fibroblasts (CAFs) on the invasion and metastasis of breast cancer, and the mechanism is not clear. This study explored the effect of autophagy on the EMT process of MCF-7 cells by CAFs autophagy in breast cancer. Methods the normal fibroblasts of CAFs and matched human breast cancer were used by the collagenase digestion method. Cells (NBFs) were cultured in primary culture and identified by immunofluorescence and Western blot; the co culture of CAFs and NBFs and MCF-7 conditioned medium (CM) and Transwell chamber co culture model were divided into 3 groups, the blank group, MCF-7 single culture group (CON), and the control group, the normal breast cancer fibroblast and MCF-7 co culture group (NBFs). In the experimental group, the invasion and migration of breast cancer related fibroblasts and MCF-7 co culture group (CAFs).Transwell were tested for the invasion and migration of MCF-7 cells in each group. The expression of the EMT epithelial markers E-cadherin protein and the interstitial marker molecule N-cadherin and Vimentin protein in MCF-7 cells were detected by Western blot; Western blot The expression of CAFs and NBFs autophagy related proteins LC3B, Beclin1 and p62 were detected, and the autophagy inhibitor 3MA was used to detect the difference in the expression of autophagy related proteins above the CAFs after CAFs, and the autophagy inhibitor, 3MA pretreated CAFs, was used to collect CM and MCF-7 co culture, and the blank group was a separate culture group, and the control group was the control group. MCF-7 and CAFs-CM co culture group (CAFs-CM), the experimental group was MCF-7 and 3MA-CAFs-CM co culture group (3MA-CAFs-CM). The expression of E-cadherin protein and interstitial marker N-cadherin and Vimentin protein of EMT epithelial markers in MCF-7 cells were detected by Western blot. E-cadherin (-) with CAFs typical characteristics of myofibroblast, Transwell invasion, migration experiment confirmed that CAFs can promote the invasion and migration of MCF-7 cells, and Western blot detection showed that the expression of MCF-7E-cadherin protein in CAFs group was 0.432 + 0.012, lower than that of NBFs group and 0.659 + 0.016 in blank group, F=120.098, P0.05.. The expression of Vimentin protein in group CAFs was 0.309 + 0.065, lower than that of group NBFs and 0.062 + 0.009 in blank group, F=42.395, P 0.05.CAFs group N-cadherin protein expression was 1.439 + 0.07 compared with BNFs group 1.3347 + 0.028 and 1.176 + 0.021 table of blank group was low, F=22.578, P0.05, suggesting CAFs promoted MCF-7 to occur. MT, the expression of Beclin1 protein in CAFs cells was 2.950 + 1.261, higher than 0.862 + 0.727, t=-3.21, P0.05, and LC3B II /LC3B I ratio of CAFs cells was 2.937 + 0.194, higher than NBFs 2.314 + 0.224, t=-3.638, P0.05, which was 0.342 + 0.093, lower than 0.750 + 0.021, suggesting autophagy level The Beclin1 protein expression of CAFs cells in the treatment group was 0.211 + 0.008, which was 0.211 + 0.008, lower than 0.266 + 0.009, t=8.094, P0.05, and the ratio of LC3B II /LC3B I in the treated group was 0.496 + 0.004, lower than 0.618 + 0.022, t=9.312, P0.05. The expression was 0.307 + 0.043, higher than that of the untreated group, 0.143 + 0.008, t=-6.471, P0.05, indicating that 3MA could inhibit the autophagy level of CAFs. After autophagy, the expression of E-cadherin protein was statistically significant, F=44.157, P0.05, and the E-cadherin protein expression of MCF-7 cells in the control group was 1.209 + 0.010, and 1.062 + 0.027 in CAFs-CM group. The expression of E-cadherin protein in MCF-7 cells in group 3MA-CAFs-CM was 1.104 + 0.019, and the expression was up to P0.05 in group CAFs-CM. The expression of Vimentin and N-cadherin in the 3 groups of MCF-7 cells was statistically significant. P0.05. conclusion CAFs can promote MCF-7 EMT and enhance its invasion and metastasis ability. The MT process is suppressed.
【作者单位】： 南方医科大学珠江医院普外科;
【分类号】：R737.9

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本文编号：2033705