p53相关的长链非编码RNA在肝细胞肝癌中的作用和机制研究

发布时间：2018-06-21 15:09

本文选题：lincRNA-p21 + p53　；参考：《浙江大学》2017年博士论文

【摘要】：目的肝细胞肝癌在我国乃至全世界都拥有很高的发病率和死亡率,寻找精确诊断和治疗肝细胞肝癌的靶标是急需解决的迫切问题。p53是肝癌发生发展中的一个重要的抑癌分子,它与细胞周期阻滞、细胞凋亡和细胞衰老等均有密切的关系。长链非编码RNA作为近年来的研究热点,已经被证实与多种肿瘤生物学行为相关,并且有一些lncRNAs直接或间接受p53调控,并参与介导p53信号通路。llincRNA-p21和PANDA是两个受p53调控的长链非编码RNA,而且都转录于p21的基因座。然而,作为p53相关的两个重要lncRNAs,他们在肝细胞肝癌中的生物学作用和分子机制仍然知之甚少,有待进一步探索。方法首先,我们用qRT-PCR的方法检测lincRNA-p21和PANDA在p53依赖的DNA损伤模型和索拉非尼治疗肝癌的细胞模型中的表达,验证它们与p53的关系,并且在大样本量的肝癌肝切除和肝癌肝移植临床样本中探索它们在肝癌中的表达谱。其次,我们利用siRNA技术在肝癌细胞中敲低lincRNA-p21,使用CCK-8、流式细胞术、transwell等方法分析lincRNA-p21对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭功能的影响,并用免疫荧光和免疫印迹的方法,分析发挥生物学功能的分子机制。然后,我们利用慢病毒感染技术在肝癌细胞中过表达PANDA,使用CCK-8、EdU、皮下成瘤、细胞周期、衰老染色、免疫印迹、免疫组化等方法,研究PANDA对肝癌的增殖和衰老的影响,并用qRT-PCR的方法找到PANDA的作用靶基因IL8,通过质粒转染技术过表达IL8,观察其对PANDA的功能拯救效果,再通过启动子荧光双报告和RNApull down技术探索PANDA调控IL8的分子机制,并通过临床样本验证IL8与PANDA的共表达关系。结果首先,我们发现lincRNA-p21和PANDA在p53依赖的DNA损伤模型中明显上调,在肝癌肝切除和肝癌肝移植临床样本中的表达量均明显低于相邻的癌旁组织,并且lincRNA-p21在索拉非尼的治疗过程中明显上调。其次,我们观察到,当llincRNA-p21被敲低时,肝癌细胞的活力增强、细胞周期进展加快、细胞迁移和侵袭能力变强、细胞形态和骨架变得更加灵活,并且相关MMP家族蛋白被上调,肝癌细胞由上皮型向间质型转变,同时伴随着EGFR入核增加。然后,我们发现,当PANDA在肝癌细胞中被过表达时,它能促进体外培养肝癌细胞和皮下种植瘤的生长,可能与细胞周期无关,随后我们发现PANDA过表达中衰老的肝癌细胞所占比例降低,相关衰老的标志包括衰老染色、pl6和y-H2AX等均有所降低。其中PANDA的下游靶基因衰老相关的炎症因子IL8明显降低。过表达IL8可以逆转PANDA在肝癌中的作用,并且IL8与PANDA在临床样本中存在着负相关。最后我们发现PANDA能够直接抑制IL8的转录活性,但并不与IL8蛋白质结合。结论lincRNA-p21和PANDA在肝癌中受p53调控,并在肝癌中显著低表达。敲低lincRNA-p21能够促进肝癌细胞活力、周期进展、迁移和侵袭,可能与lincRNA-p21影响肝癌细胞骨架和EGFR的亚细胞定位相关。过表达PANDA能够促进肝癌增殖和抑制肝癌衰老,可能与PANDA能够抑制衰老相关炎症因子IL8的转录活性相关。p53相关的lincRNA-p21和PANDA在肝癌中均发挥着重要的作用,可能成为肝细胞肝癌诊断的新型标志和治疗的潜在靶点。
[Abstract]:Objective To investigate the effects of the expression of lincRNA - p21 and PANDA on the proliferation , migration and invasion of human hepatocellular carcinoma ( HCC ) by means of qRT - PCR . Conclusion PANDA can inhibit the proliferation of liver cancer cells and inhibit the aging of liver cancer cells . Conclusion The expression of IL 8 can inhibit the proliferation of liver cancer cells and inhibit the senescence of liver cancer .
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.7

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