Notch通路在烟草诱导肺癌发生中的作用及其分子机制研究

发布时间：2018-06-23 12:46

本文选题：Notch通路 + 烟草　；参考：《山东大学》2016年博士论文

【摘要】：背景肺癌严重危害人类健康,其发病率和死亡率均居全球癌症首位。肺癌细胞生物学特性比较复杂,且恶性程度高,约75%的肺癌患者被确诊时已属中晚期。因此深入研究肺癌发生发展中关键的病因及分子机制,以寻找早期诊断,早期干预的措施,对改善肺癌的预后具有十分重要意义。吸烟是导致肺癌发生的最重要危险因素,大量流行病学调查证实约90%肺癌相关死亡病例与吸烟有关。与非吸烟者相比,吸烟可使肺癌的发病风险升高30倍。此外,吸烟也是肺癌手术患者预后差的因子。卷烟烟气中尼古丁、4-甲基亚硝胺基-3吡啶-1-丁酮(NNK)和多环芳烃等70多种致癌物[8],可通过影响细胞受体、细胞周期调节控制因子、信号通路、凋亡调节因子、血管生成因子等的改变导致肺癌的发生以及侵袭和转移。但其具体分子机制至今尚未完全阐明,限制烟草学研究的主要问题是影响因素多,构建吸烟致癌模型较为困难、研究周期长等。但是阐明烟草致癌机制对科学预防和早期干预意义重大。Notch信号通路是介导相邻细胞和细胞之间直接接触的重要信号通路之一,在细胞发育、生长和分化过程中发挥重要作用。Notch信号通路由4种受体、5种配体和下游的效应信号转导分子构成。该通路在肿瘤中的作用近年来引起诸多学者的关注。与肿瘤发生发展较为密切的是Notch1、Notch2受体,Notch通路失调在肿瘤细胞生长、代谢、细胞周期及凋亡等生物学过程中发挥重要作用。宫颈癌、乳腺癌和肝癌中均发现Notch1异常活化,促进肿瘤生长,但最近在膀胱癌研究中发现,Notch通路通过抑制ERK通路发挥抑癌基因功能。可见Notch通路的调控异常复杂,取决于肿瘤遗传学背景和外源性刺激信号。在肺发育早期,Notch通路分布在上皮细胞中,担任促增殖,抑制细胞分化的角色,属早期胚胎发育基因[15]。Notch活化对胚胎干细胞维持自我更新与多向分化潜能至关重要[16]。如果成熟机体内Notch过度激活则会阻碍细胞正常分化,使上皮细胞极性紊乱而驱动向肿瘤细胞转化。有研究发现三分之一非小细胞肺癌患者(NSCLC)中出现Notch通路异常,异常激活的Notch通路和较差的预后密切相关[17],体外研究还发现Notch通路需要乏氧环境才能促进肺癌细胞的侵袭生长[18]。在急性淋巴细胞白血病中发现Notch通路存在激活突变,但在实体瘤中争议较大,Notch突变在肺癌发生中的作用有待证实。作为最重要的外源性刺激因素,吸烟对Notch通路的影响尚未见研究报道。本研究通过体内外实验系统探讨了Notch通路在烟草诱导肺癌中的确切作用及其分子机制,为明确烟草致癌机制及高危人群的早期干预提供了关键实验依据。第一部分烟草诱导肺癌发生模型的建立[目的]采用卷烟烟气凝集物(cigarette smoke condensate,CSC)长期诱导人永生化人支气管上皮细胞株(immortalized human bronchial epithelial cells)BEP2D恶性转化,并接种裸鼠皮下成瘤；同时利用动物吸烟机建立A/J小鼠烟熏成瘤模型[方法]1.利用CSC对人永生化支气管上皮细胞BEP2D持续进行诱导至70代,并用姬姆萨染色观察细胞形态、克隆形成率、生长曲线、血清抗性实验、软琼脂克隆形成能力对恶性表型进行观察2.PO、酒精组细胞(溶媒对照)、P10、P30、P50、P70细胞分别加入凋亡诱导剂依托泊苷(Etoposide),24h后Annexin V-PI双染法检测细胞凋亡3.Western blot检测PO、酒精组、P10、P30、P50、P70细胞中抗凋亡蛋白家族(1AP)成员XIAP、Survivin、c-IAP-1、c-IAP-1和促凋亡蛋白RARP表达4.P0、P50、P70细胞接种裸鼠,观察成瘤情况,成瘤后测量瘤体大小,处死成瘤裸鼠,进行HE染色和免疫组化染色鉴定5.以自发成瘤倾向的A/J小鼠为模型,随机分为两组(每组40只)即正常对照组和烟熏组,将小鼠置入专用动物吸烟机中进行烟气暴露实验,在烟熏前、1月、3月、9月每组分别取10只小鼠肺组织,进行HE染色观察肺部成瘤情况,通过免疫组化检测抗凋亡蛋白XIAP、Survivin表达,原位末端标记(TUNEL)法检测小鼠肺组织和瘤体组织的细胞凋亡水平,观察吸烟对细胞凋亡的影响；小鼠烟熏成瘤后进行HE和免疫组化染色进行鉴定。[结果]1.随着染毒代数的增高,细胞出现病理性核分裂象,核浆比增大；P30、P40、 P50、P60、P70细胞增殖速度在24h、48h、72h显著快于正常及酒精对照组细胞(P均0.05)；P20、P30、P40、P50、P60、P70细胞克隆形成率明显高于P0及酒精对照组细胞(P均0.05)；同P0及酒精对照组相比,P30、P40 P50、P60、P70细胞均出现显著的对血清促分化能力的抗性(P均0.05);P30、P40、P50、P60、P70细胞的软琼脂克隆形成随着CSC染毒代数增高而增高,与P0及酒精对照组比较差异有统计学意义(P均0.05)2.P0、酒精组细胞、P10、P30、P50细胞加入Etoposide后细胞凋亡率显著增高(P均0.01)；P70细胞加入Etoposide后,两组凋亡率无显著差别(P0.05)3.XIAP、Surviving、在P50、P70细胞中表达高于其他各代细胞,RARP在P50、P70细胞中表达低于其他各代细胞；c-IAP-1、c-IAP-2表达水平在各代细胞无明显差异4.恶性转化细胞裸鼠接种模型显示,P70细胞组接种4月后全部成瘤,PO和P50细胞组无成瘤。瘤体HE染色显示：差分化腺癌,免疫组化显示：CK7和TTF-1强阳性,CK56、P63和CKH均阴性,综合上述分子标志物表达证实裸鼠成瘤为腺癌5.A/J小鼠在9月时发生肺部肿瘤,10只全部成瘤,对照组均无成瘤,肿瘤HE染色提示：2例腺瘤,8例为腺癌,8例瘤体免疫组化染色提示：TTF-1强阳性,P63和CK56阴性,证实肺腺癌；与对照肺组织相比,肿瘤中XIAP和Survivin表达显著增高(P0.01)；fUNEL染色提示：与对照小鼠肺组织相比,肿瘤组织细胞凋亡率显著降低((P0.01)[结论]恶性表型鉴定和裸鼠成瘤表明CSC成功诱导BEP2D恶性转化,A/J鼠烟熏9月发生肺癌,为下一步研究烟草致癌机制提供了理想的体内模型第二部分Notch通路与吸烟诱导肺癌发生的相关性[目的]采用人基因表达谱芯片方法筛选出CSC诱导的恶性转化细胞差异表达基因并用Realtime PCR(qPCR)、Western blot和免疫荧光等方法验证；检测A/J烟熏小鼠气道粘膜的Notch通路分子表达；检测重度吸烟人群气道粘膜和肺癌组织中Notch通路分子表达,分析与吸烟的相关性,明确Notch通路在吸烟诱导肺癌发生中的确切作用[方法]1.选取P0和P70细胞,采用Affymetrix基因表达谱芯片方法(Gene Chip prime view human)分析差异表达基因2.根据基因芯片筛选结果,运用qPCR检测PO、酒精组、P10、P30、P50、P70细胞中17个Notch通路主要基因：Notch1,Notch2、Notch3、Notch4、JAG1 、JAG2、DLL1,DLL3、Hes1、Hey1、Hey2、HeyL、Hes5、RBPJ、MIB2 、DNM1、Numb mRNA表达；根据Realtime qPCR结果,Western blot检测上述各代细胞中Notch1,Notch2、JAG1、JAG2、RBPJ、Hes1、Hey1、Hey2、 DNM1、Numb蛋白表达3免疫荧光法检测P0和P70细胞Notch1,Notch2、JAG1、Hes1、Hey1、Hey2表达,观察两组细胞荧光表达强度和蛋白定位4.免疫组化法检测烟熏前、1月、3月、9月时A/J小鼠肺组织和肿瘤中Notch1 ,Notch1 Numb表达,在体动态观察吸烟对Notch通路的影响5.筛选20例重度吸烟和不吸烟非肿瘤患者,通过特殊光气管镜活检支气管粘膜组织,RT-PCR检测Notch1,Notch2、JAG1、JAG2、Hes1、 Hey1、Hey2、 RBPJ、Numb mRNA表达,比较上述基因表达水平与吸烟的相关性6.收集50例非小细胞肺癌手术石蜡标本(29例吸烟,21例非吸烟),免疫组化法检测癌组织Notch1、Notch2、Hes1、Numb表达,比较上述蛋白表达水平与吸烟的相关性[结果]1.聚类分析显示P70细胞中MAPK、P53、细胞周期调节通路等与肿瘤发生发展密切相关的通路显著激活,说明转化细胞具备恶性生物学特征。同时发现多个Notch通路基因在P70和P0细胞存在差异表达(2倍以上差异)2.与P0和酒精组细胞相比,P70细胞Notch1、Notch2、Hes1、JAG1、Hes1、Hey1 、Hey2、RBPJ mRNA显著上调(P均0.05)；MB2、DNM1、Numb mRNA显著下调(P均0.05)；Notch3、Notch4、DLL1、DLL3、Hes5、HeyL和JAG2 mRNA水平在P0和P70之间无显著性差异(P均0.05)；动态观察细胞mRNA表达变化发现：Notch2 mRNA水平CSC诱导早期(P10细胞)即有显著上调,随后略有下降,在P70细胞再次升高,多数Notch通路基因Notch1、 Hes1、JAG1、Hes1、Hey1、Hey2、RBPJ在P30细胞不同程度升高,P70表达上调最显著3.P70细胞中Notch1、Notch2、Hes1、Hey1、Hey2、JAG1、RBPJ蛋白表达水平显著高于P0和酒精组,Notch2在P10即出现早期表达显著增高,负调控因子中Numb在P0和酒精组表达高于其余各组,P10表达显著显著下降,至P70细胞呈现乏表达状态。各代细胞均未检测到DNM1和JAG2表达。4 P70细胞中Notch1、Notch2胞浆的表达荧光强度、Hes1、Hey1、Hey2胞核的表达荧光强度和JAG胞膜的表达荧光强度显著高于PO细胞5.Notch 1阳性细胞数在小鼠肺癌中表达最高,显著高于烟熏前、烟熏1月、3月时肺组织的表达水平(P0.01),而对照组Notch 1表达水平无明显变化。Notch2在肿瘤中表达最高,在腺瘤中中等强度表达,烟熏3月肺组织中Notch2表达即明显升高,与对照组表达水平有显著差异(P0.01),Numb蛋白在烟熏1月肺组织中即有表达下降,但无统计学差异(P0.05),烟熏3月时阳性细胞数显著低于对照组小鼠(P0.01)。Numb在肿瘤中表达最低,与对照组有显著性差异(P0.01)6.重度吸烟癌前病变患者支气管粘膜组织中Notch2、Hes1、Hey1、Hey2、JAG1、 RBPJ mRNA表达水平显著高于不吸烟人群(P0.05),Numb mRNA水平显著低于不吸烟人群(P0.01),Notch1和JAG2在两组人群中表达无差异(P0.05)7.重度吸烟患者肺癌组织中Notch1、Hes1表达显著高于非吸烟肺癌(P0.05),Numb表达显著低于非吸烟患者(P0.05),Notch2在两组肺癌人群中并无差异,但在吸烟腺癌中表达显著高于非吸烟患者(P0.01),而在鳞癌中,Notch2表达与吸烟无显著相关性(P0.05)。Notch 1无论在腺癌还是鳞癌中,吸烟患者表达水平均高于不吸烟者(P0.05),Pearson相关性分析表明：肺癌组织中Notch 1表达与Numb表达呈低度负相关(r=-0.383 P0.05),Notch2表达与Numb表达显著负相关(r=-0.542,P0.01)。戒烟不足1年或未戒烟者和戒烟史超过1年的肺癌患者组织中Notch1、Notch2表达无差异(P0.05)[结论]烟草激活Notch通路,并与吸烟相关肺癌的发生发展密切相关,Notch2上调可能可能是烟草诱导肺癌发生的早期分子事件。第三部分烟草活化Notch通路的分子机制[目的]探讨Numb对Notch2表达的调控作用；通过Notch1、Notch2编码区基因突变检测,分析吸烟对Notch编码区突变发生频率的影响[方法]1.免疫荧光检测P0和P70两组细胞中的Notch2和Numb的表达；构建Numb过表达质粒pIRES2-EGFP-Numb(pIRES2-Numb),通过脂质体3000转染P70细胞,激光共聚焦显微成像系统观察Numb、Notch2荧光强度,并计算相对荧光强度值2.通过细胞克隆实验观察转染pIRES2-Numb对P70细胞克隆形成的影响3.PCR重测序法检测P0、P50、P70细胞和34例JNSCLC组织标本的Notch1、Notch2编码区基因突变,比较吸烟组和非吸烟组各个突变位点的发生频率,并用免疫组化方法检测突变频率有差异的NSCLC组织中Hes1表达[结果]1.P70细胞中Notch2蛋白的荧光强度显著高于P0,P0细胞中Numb蛋白的荧光强度显著高于P70细胞。与空质粒(pIRES2)组相比,pIRES2-Numb显著增加了Notch2蛋白的相对荧光强度值(P0.01)2.pIRES2-Numb组细胞克隆形成数显著低于pIRES2组(P0.01)3.通过Notch 1编码区测序分析,在外显子3、14、27和34共发现5种SNPs,均为同义突变：rs10521 (p.Asp1698=)、rs2229971(p.Asn755=),rs2229974(p.Asp2185=), rs3812596(p.Pro2216=), rs4489420(p.Asn104=)。吸烟NSCLC患者平均每例Notch1编码区发生SNP的数量是3.00±1.00,高于非吸烟患者的1.13±0.83(P0.01),比较吸烟组和非吸烟组每个SNPs的发生率,差异无统计学意义(Fisher精确概率法P0.05)。P70细胞Notch2编码区检测到7个SNPs(c.57G、c.710GA、c.5065AT、c.7042TC、c.3234CT、c.572AT和c.2882GA),频率高于P50细胞(c.57CG、c.710GA、c.3234CT和c.572AT)和PO细胞(c.57CG和c.2622TC)4.通过Notch2编码区测序分析,在外显子1、4、17、18、20、28和34共检测到9种突变序列：包括3种同义突变：rs11810554、rs61734328和rs7543643；3种错义突变rs146498360(p.Arg237G1n)、rs2603926 (p.Ala21Thr)和rs60854092(p.Ile1689Phe);3种新发突变：包括1种同义突变c.2622TC (p.Ile874=),2种错义点突变c.572AT(p.His191Leu), c.2882GA (P.Gly961Glu)。吸烟患者平均每例Notch2编码区发生SNP的数量是1.32±1.16,高于非吸烟患者的0.33±0.61(P0.01),每个SNPs的发生率,在吸烟组和非吸烟者中差异均无统计学意义(P0.05)；P70细胞Notch2编码区检测到7个SNPs(c.57CG、c.710GA、c.5065AT、c.70421C、 c.3234CT、c.572AT和c.2882GA),频率高于P50细胞(c.57CG、 c.710GA、c.3234CT和c.572AT)和P0细胞(c.57CG和c.2622TC)5.6种突变：：p.Arg237GIn、P.Ile1689Phe、p.Leu2348=、p.His191Leu、p.Ile874=和p.Gly961Glu仅在吸烟患者中出现,非吸烟患者未见携带；比较了携带上述六个突变的患者与其他野生型患者组织标本中Hesl免疫组化的表达差异,结果显示：除p.I1e874=外,其余突变中Hes1表达积分均显著高于野生型(P0.01),表明Notch2以活化突变为主[结论]Numb负调控失调和Notch编码区突变可能是烟草诱导人支气管上皮细胞恶性转化的关键分子机制。第四部分Notch通路促进人永生化支气管上皮细胞恶性转化的作用及其分子机制[目的]通过体内外实验证实Notch通路是否具有促进烟草诱导肺癌发生的作用,并比较Notchl和Notch2在细胞恶性转化中的不同作用；探讨Notch通路促进烟草诱导人支气管上皮细胞恶性转化的分子机制[方法]1.构建慢病毒shRNA-Notch 1 (Notch 1-KD)和shRNA-Notch2(Notch2-KD)载体,并感染P70细胞,qPCR检测干扰效率,MTT和细胞克隆实验观察细胞增殖和细胞克隆的变化2. Notch1过表达质粒pIRES2-EGFP-Notch1 (pIRES2-Notch 1)、Notch2过表达质粒pIRES2-EGFP-Notch2(pIRES2-Notch2)分别转染P0细胞,Western blot检测Notch1和Notch2表达,MTT和细胞克隆实验观察细胞增殖和细胞克隆的变化3.在Notch1-KD和Notch2-KD感染的P70细胞,分别加入凋亡诱导剂Etoposide,单染法检测细胞凋亡4.在pIRES2-Notch1、pIRES2-Notch2转染的P0细胞,分别加入Etoposide,单染法检测细胞凋亡5.Western blot检测各组细胞XIAP、Survivin、Cleaved caspase-3、RARP表达6.采用Puromycin(嘌呤霉素)筛选稳定转染慢病毒Notch 1-KD、Notch2-KD的细胞株,Western blot验证Notch1、Notch2表达下调情况；应用上述稳转细胞株,构建裸鼠移植瘤模型,观察成瘤情况、瘤体生长、免疫组化检测Notch1、 Notch2、Ki67、XIAP、Survivin表达,TUNEL法检测瘤体组织凋亡[结果]1.Notch 1-KD敲减效率75.3%,Notch2-KD敲减效率83.6%,干扰效率较好,可以满足后续功能学实验要求；Notch1-KD和Notch2-KD均能显著抑制P70细胞生长(P0.05),抑制P70细胞的克隆形成能力(P0.01),NC(空病毒组)与空白对照组相比均无显著性差异(P0.05)。2.pIRES2-Notch1、pIRES2-Notch2转染P0细胞72h后,与脂质体和pIRES2组相比,Notch1、Notch2表达显著升高(P0.01)。pIRES2-Notch2显著增强P0细胞增殖能力和细胞克隆形成能力(P均0.01),pIRES2-Notch1组与pIRES2、脂质体组相比增殖能力和细胞克隆形成率均无显著性差异(P0.05)3. Annexin V-APC法凋亡检测显示：Notch 1-KD和Notch2-KD不仅诱导细胞基础凋亡量的增加(P尔0.01),并且显著增强Etoposide诱导P70细胞的凋亡(P均0.05),Notchl-KD诱导细胞凋亡率高于Notch2-KD (P0.05), NC组和对照组凋亡率无显著差异(P0.05)4. pIRES2-Notch1、pIRES2-Notch2转染P0细胞72h后,pIRES2-Notch2显著抑制了Etoposide诱导P70细胞的凋亡(P均0.05),pIRES2-Notch1组、pIRES2、脂质体组加入Etoposide,凋亡率显著增高(P均0.05)5. Noch1-KD和Notch2-KD可以促进PARP和Cleaved-caspase-3的表达,加入Etoposide后PARP和Cleaved-Caspase-3蛋白上调更为显著,Noch1-KD显著下调Survivin表达,Notch2-KD显著下调XIAP表达6.嘌呤霉素反复筛选,成功构建稳定感染Notch1-KD、Notch2-KD的P70稳转细胞株,经过Western blot验证,目的蛋白较对照组显著下调。将该细胞接种裸鼠。空病毒组成瘤率最高83%(5/6),高于Notch2-KD组50%(3/6)和Notch1-KD组33%(2/6)。免疫组化检测瘤体Notch1、Notch2表达,证实Notch 1和Notch2在KD组表达显著低于NC组(。肿瘤生长曲线显示,Notch1-KD组和Notch2-KD组生长速度明显低于NC组(P0.05),Notchl-KD组生长速度、瘤体重量和Ki67表达均低于Notch2-KD组(P均0.05)；TUNEL检测显示,Notch1-KD组TUNEL阳性细胞的比例高于Notch2-KD(P0.05),两组均显著高于NC组(P0.01)。Notch1-KD组Survivin表达显著下调(P0.01),而在Notch2-KD组XIAP表达下调较其他各组显著(P0.01)[结论]Notch通路通过促进XIAP、Survivin表达调控细胞凋亡,促进CSC诱导的支气管上皮细胞的恶性转化,Notch2在恶性转化的早期发挥主导作用,Notch1对后期维持转化细胞的恶性表型发挥关键作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2

【参考文献】