PEITC对神经胶质瘤LN229细胞凋亡影响及机制的研究

发布时间：2018-07-03 13:54

本文选题：苯乙基异硫氰酸酯(PEITC) + 神经胶质瘤　；参考：《山东大学》2016年博士论文

【摘要】：研究背景人脑胶质瘤是最常见的原发中枢神经系统肿瘤,约占所有中枢神经系统肿瘤的30%,脑恶性肿瘤的80%。其较高的发病率和病死率使其成为颅内最难攻克的肿瘤。尽管目前人脑胶质瘤的诊断、手术治疗、化学治疗和放射治疗等方面的有了一定提高,胶质母瘤的预后仍非常差,中位生存期一般只有12-15个月而且生活质量非常差。胶质瘤的症状取决于侵及的部位,可因颅内压增高出现头疼,呕吐,癫痫发作,颅神经缺失等症状。外科手术结合放疗和化疗的综合治疗是目前主要治疗手段。手术治疗很难全切肿瘤,术后复发率很高。目前临床上,替莫唑安(TMZ)作为一线化疗药物用于治疗胶质母细胞瘤。但是由于血脑屏障、06-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(06-methylguanine-DNA methyltransferase, MGMT)基因启动子甲基化率低、多重抗药性等因素,胶质母细胞瘤以替莫唑安为基本药物的放化疗效果也不理想。因此探索新的有效治疗方法包括新的化疗药物治疗胶质瘤迫在眉睫。选择利用天然产物合成抗癌药物具有成本低,易获得,毒性小或无毒,且已经在中药使用过等特点,越来越受到人们的重视。芥子油甙存在于所有十字花科植物中如西洋菜、西兰花、甘蓝等,借助于植物中葡糖硫苷酶作用,髓过切割和咀嚼等机械性损伤可将芥子油甙转变为有确实生物活性的物质,即异硫氰酸盐(isothiocyanates, ITCs)。异硫氰酸苯乙酉(phenthyl isothiocyanate,PEITC)则是以ITCs为基础,通过人工合成的方式获得的一种异硫氰酸化合物。以前的研究已经证实PEITC具有广谱和明显的抗肿瘤作用,他的机制是通过诱导细胞凋亡和逆转化疗药物抗药性。PEITC在恶性癌细胞具有强大的诱导活性氧产生作用,而在正常细胞没有,因此可以选择性杀死恶性癌细胞而不是相应的正常细胞。作为一个天然化合物,PEITC不像许多传统的抗癌药物,没有呈现任何严重毒性反应。我们猜测PEITC对于恶性胶质瘤细胞是不是也有同样的抗肿瘤作用。PEITC的抗癌活性可以分为化学预防作用和化学治疗作用,世界上不同地方的多个流行病学研究提供很强的证据证明饮食摄入越多十字花科蔬菜,患癌症的风险越小。虽然化学预防作用已经通过流行病学的证据被证实,而化学治疗作用的详细机制研究正在通过各种临床前期试验进行评估包括化学致癌模型及转基因大鼠模型。PEITC的化学预防作用。一般癌症的发生是由于致癌毒物的生物激活和阶段Ⅰ药物代谢酶的水解。因此调整阶段Ⅰ酶可以影响致癌物的活性过程。PEITC显示有双重作用于阶段Ⅰ酶,例如一方面诱导产生CYP1A1和CYP1A2,另一方面抑制某些细胞色素P450酶的活性如CYP2E1, CYP3A4和CYP2A3。阶段Ⅱ酶在解毒和致癌中发挥重要作用。PEITC诱导阶段Ⅱ解毒酶的产生,可以解释它的化学预防作用。PEITC的化学治疗作用,两个被证实的主要机制是细胞周期阻滞和诱导细胞凋亡。PEITC调整活性氧(ROS)的产生,导致细胞毒效应特别是癌细胞,也被认为是主要机制。ROS导致线粒体调整Bcl2, BID, BIM and BAX蛋白的表达,引起细胞色素C的释放,诱导细胞凋亡。另一个诱导ROS毒性机制是抑制ROS的解毒作用,每个细胞都有良好的保护机制防止活性氧引起的损伤。首先是活性氧的清除机制包括超氧阴离子对氧及双氧水的歧化作用。其次过氧化氢被谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)转化成水或被过氧化氢酶分解为氧气和水。谷胱甘肽(GSH)是GPX的一个底物。PEITC与GSH结合引起癌细胞内GSH的耗竭导致活性氧诱导的细胞损伤。有趣的是GSH的浓度与PEITC的敏感性有关,细胞内GSH的浓度越高对PEITC的敏感性相对也越高,这可能解释对癌细胞和正常细胞的选择性,因为癌细胞较正常细胞有更高水平的GSH。目的：肿瘤的发生发展非常复杂,涉及到多个基因和多个通路的紊乱,在国际上已引起了科学家们的高度重视。尽管近年来国内外在肿瘤的预防和治疗研究方面取得了较大的进展,但是恶性肿瘤造成的患者死亡率仍然很高,对肿瘤的预防和治疗仍然是医学科研界面对的一大难题。因此提高肿瘤的治愈率或减少肿瘤的死亡率是显著研究的重点。目前微创治疗和靶向抗肿瘤药物治疗是治疗肿瘤的发展趋势,特别是开发高效且低毒的靶向药物。近年来,随着越来越深入的研究,对癌症的化学预防方式备受关注。研究发现,人们日常食用的植物或水果中含有丰富的抗肿瘤成分,如葡萄中含有漆树黄酮,绿茶中含有茶多酚,以及十字花科植物中含有的异硫氰酸酯等。流行病学研究已经表明,十字花科植物,如萝卜、白菜、西兰花、花椰菜以及芥菜等硫代葡萄糖苷含量都较高,当植物组织或植物细胞遭到外力被破坏后,细胞内的硫代葡萄糖苷会被细胞内自身的黑芥子酶水解产生具有抗癌活性的异硫氰酸酯。因此,增加十字花科植物的摄取会很大程度降低癌症的发生率。异硫氰酸酯是一种具有强的刺激性气味的物质,而且容易挥发,容易溶于乙醚和乙醇等有机溶剂中,其稳定性受环境酸碱度和温度的影响较大。常见或研究较多的异硫氰酸酯类化合物包括苯乙基异硫氰酸酯(phenethyl isothiocyanate, PEITC)、烯丙基异硫氰酸酯、莱菔硫烷以及莱菔素等。在比较异硫氰酸酯和腈类物质的生物学活性时发现,异硫氰酸酯可以显著的诱导Ⅱ型解毒酶的产生,而腈类物质不能。神经胶质瘤是一类中枢神经系统最常见的发生于人神经上皮的恶性肿瘤,其发病率、复发率和死亡率都较高,具有入侵快、治愈难和细胞异质性的特点。神经胶质瘤在原发性脑肿瘤中的比例高达40%～60%,根据分化程度的不同分为星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤以及少突胶质细胞瘤等。神经胶质瘤分化成星形细胞瘤和胶质母细胞瘤的患者,其1年内的最大存活率仅为5%。由于神经胶质瘤具有分化能力差、侵袭能力强和增殖速率快等特点,常规采用的手术治疗方法还不能彻底清除肿瘤细胞；另一方面,由于肿瘤细胞对长时间的辐射会产生耐受性从而导致残余病灶的复发率高。此外,机体产生的肿瘤耐药性和个体间的用药差异性和肿瘤组织内及周边水肿组织间隙的静水压高等因素都会降低化疗的效果。此外,由于手术治疗恶性胶质瘤特别是高分化的胶质瘤细胞的局限性,其发生率和死亡率都较高,且术后平均生存时间少于一年。因此,如何将神经胶质瘤细胞的完全清除仍然是研究者们面临的一大难题,寻找新的治疗方法至关重要。寻找能够抑制被异常激活的神经胶质瘤信号通路的药物是杀死肿瘤细胞、抑制肿瘤细胞增殖,进而治疗神经胶质瘤的有效手段之一。近年来,随着对异硫氰酸酯(isothiocyanates, ITCs)的深入研究,其显著的抗癌活性备受研究者们关注,已成为预防癌症发生发展的最具潜力的天然功能因子之一。目前已经证明的具有抗肿瘤活性的异硫氰酸酯类化合物有二十余种。其中,萝卜硫素(SFN, sulforaphane)可以抑制小鼠多种癌症包括食道癌、胃癌、肝癌及膀胱癌的进展；而由N-亚硝基甲基一苄基胺(NB MA)、对由亚硝胺、苯并芘、甲基偶氮甲醇乙酸酯(MAM)、4-甲亚硝胺基-3-3吡啶-1-丁酮(NNK)等致癌物造成的小鼠肝癌、肺癌、肠道癌及食道癌会被苯甲基异硫氰酸酯(BITC, benzylisothiocyanate)和苯乙基异硫氰酸酯有效抑制。PEITC可显著抑制吸烟造成的大鼠肺癌和食道癌的发生。目前公认的异硫氰酸酯的抗癌和抗肿瘤活性是通过降低阶段Ⅰ酶或提高阶段Ⅱ解毒酶的活性,从而提高机体对致癌物的代谢能力和解毒、脱毒能力实现的。另外,癌症的发生发展与机体所受的氧化损伤程度也密切相关,具体表现为细胞内自由基含量的增加和相关氧化酶系的变化。苯乙基异硫氰酸酯是异硫氰酸酯家族成员之一,由于其具有显著的化学预防作用而受到广泛关注,是研究最广泛的一种。多项研究已经证实苯乙基异硫氰酸酯具有显著的抗肺癌和白血病细胞等的活性。因此,苯乙基异硫氰酸酯将会是最具有临床应用前景的癌症预防和治疗的药物之一。目前,美国安德森癌症中心正在进行使用苯乙基异硫氰酸酯治疗肺癌和乳腺癌的I期临床试验(专利号：NCICN-55120)。同时,明尼苏达州立大学和Masonic肿瘤研究中心联合国家癌症中心也在展开苯乙基异硫氰酸酯治疗肺癌的II期临床试验。本研究旨在探索苯乙基异硫氰酸酯对人类神经胶质瘤细胞LN229的生长影响极其影响机制,为将苯乙基异硫氰酸酯应用到预防和治疗人神经胶质瘤提供依据。方法：本研究的研究对象是人神经胶质瘤LN229细胞,利用MTT试验检测PEITC对肿瘤细胞的生长和增殖的影响。MTT是一种黄色染料。在细胞线粒体内含有的琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的共同作用下,MTT被代谢还原为蓝紫色且不溶于水的甲佨,通过测定490 nin处甲躜的含量就可推测活细胞的数量。通过Annexin-V-FITC/PI流式细胞术分析PEITC对神经胶质瘤细胞周期和细胞凋亡的影响。Annexin-V是一种依赖于Ca2+的磷脂结合蛋白,当在Ca2+存在条件下,Annexin-V可以与细胞表面的磷脂酰丝氨酸结合,使磷脂酰丝氨酸暴露在细胞膜外标志着细胞凋亡的开始；PI是一种DNA染料,当细胞进入凋亡晚期后,细胞膜的通透性会发生变化,此时PI进入细胞并与细胞内的DNA结合,因此,通过Annexin-V/PI双染色法就可以检测到细胞凋亡,分析细胞内的DNA含量的不同研究细胞周期的变化。利用DCFH-DA探针法检测肿瘤细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)和谷胱甘肽(glutathione, GSH)的表达水平。DCFH-DA探针是用于特异的鉴定细胞内ROS含量,其可以穿过细胞膜并被酯酶催化水解形成DCFH,而细胞内的ROS可以将无荧光标记的DCFH转变为有荧光标记的DCF。所以,通过检测细胞内DCF的荧光强度就可以鉴定细胞内ROS的水平变化。同时通过酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELI SA)检测用PEITC处理后,肿瘤细胞内超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)的活性。采用western blot法检测含半胱氨酸的天冬氨酸酪蛋白水解酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3, Caspase-3)活性的变化。结果：当PEITC作用于神经胶质瘤LN229细胞72小时后,细胞的生长受到显著抑制,且这种抑制作用具有PEITC浓度依赖性(IC50=20uM)。结果还显示,当浓度分别为10μM和20 μM的PEITC时,PEITC对细胞生长的抑制率较高,而且对正常细胞表现出无毒或弱毒性。因此,在接下来的研究中本文选择的PEITC浓度分别为10μM和20μM。流式细胞术分析PEITC对神经胶质瘤LN229细胞凋亡的影响,结果显示：分别用10μM和20 μM的PEITC处理LN229细胞24小时后,对照组的细胞凋亡率仅为5%；10 gM的PEITC处理后细胞凋亡率为30.3%(P0.05)；而20μM的PEITC处理后细胞凋亡率高达64.9%(P0.05)。同时,流式细胞术分析结果还显示处于G2/M期的细胞比例明显上升,而G0/G1期的细胞比例明显下降(P0.05)。对ROS表达水平的检测结果显示101μMPEITC组细胞的ROS表达量比对照组高4倍,而20 μM PEITC组细胞的ROS表达量比对照组高6倍,且统计分析具有统计学意义(P0.05)。此外,用10μM和20μM的PEITC分别处理LN229细胞24小时后,肿瘤细胞内GSH和SOD的表达水平明显降低。10μM PEITC组20 μM PEITC组细胞内的GSH表达量与对照组细胞GSH表达量相比仅为69.3%和42.4%(P0.05)；而10 μM PEITC组和20 μM PEITC组细胞内的SOD表达量与对照组细胞SOD表达量相比仅为60.7%和20.6%(P0.05)；而且肿瘤细胞内caspase-3的活性与对照组(β-actin)相比显著增加(P0.05)。结论：PEITC具有抑制神经胶质瘤细胞LN229生长、促进凋亡以及阻滞细胞周期的功能；而且PEITC显著增加肿瘤细胞内的ROS水平,并抑制SOD和GSH的表达,从而诱导caspase-3的降解/活化,最终加速肿瘤细胞的死亡。此外,由于PEITC主要是来自于人们日常食用的蔬菜,所以PEITC对正常细胞表现为弱毒或无毒。因此,PEITC将会是一种安全、无毒或低毒且有效的抗胶质瘤药物,可能具有一定的市场应用前景。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.41

【相似文献】