LncRNA HOTAIR与乳腺癌曲妥珠单抗耐药的关系及其机制研究

发布时间：2018-07-04 16:25

  本文选题：乳腺肿瘤 + HOTAIR　； 参考：《华中科技大学》2016年博士论文

【摘要】：目的：研究及初步探讨HOTAIR与乳腺癌曲妥珠单抗耐药的关系及其可能的分子机制。方法：(1)选取乳腺癌细胞系SK-BR-3-TS,通过间歇大剂量冲击和逐步增加剂量相结合的方法,诱导建立曲妥珠单抗耐药细胞系SK-BR-3-TR。(2) qRT-PCR检测SK-BR-3-TS和SK-BR-3-TR细胞HOTAIR的表达,MTT法检测两种细胞模型肿瘤细胞的增殖活性,流式细胞术检测细胞凋亡,transwell侵袭实验观察细胞侵袭能力,qRT-PCR和western blot分别检测细胞上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition, EMT)相关基因和蛋白TGF-β、Snail、 Vimentin和E-cadherin的表达以及PI3K/AKT/mTOR和MEK/MAPK信号通路活性。(3)甲基化特异性PCR (Methylation-Specific PCR, MSP)检测两种细胞TGF-β、 PTEN及CNK1B(P27kip1)基因甲基化水平。(4)慢病毒转染siRNA干扰实验阻抑SK-BR-3-TR细胞HOTAIR表达,反向验证HOTAIR与曲妥珠单抗耐药的关系及其分子机制。(5) BALB/c裸鼠荷瘤体内实验,分别建立SK-BR-3-TS、SK-BR-3-TR和si-HOTAIR-SK-BR-3-TR裸鼠荷瘤模型,观察三种模型瘤体生长速度；免疫组化技术检测瘤体TGF-β、Snail和E-cadherin以及PTEN、Ki67的表达水平。体内实验进一步验证HOTAIR对曲妥珠单抗耐药的影响。结果：(1)在成功诱导及稳定培养乳腺癌曲妥珠单抗耐药细胞系SK-BR-3-TR中,与曲妥珠单抗敏感细胞株SK-BR-3-TS相比,HOT AIR RNA表达水平明显上调(2.216±0.332 v 0.326±0.05,P=0.0006)。(2)MTT法、transwell侵袭实验及流式细胞术检测结果提示,与敏感细胞相比,耐药细胞增殖活性及侵袭能力增强,细胞凋亡减少。(3) qRT-PCR及WB检测显示,与敏感细胞相比,耐药细胞EMT相关基因TGF-β、 Snail及Vimentin表达上调,E-cadherin表达下调,HER2受体信号通路中HER2、 PI3K、AK、mTOR及MAPK基因表达水平及HER2受体磷酸化水平无明显变化,但p-AKT、p-MAPK及CyclinD1水平升高,而PTEN、P27水平下调。(4)MSP检测耐药细胞PTEN基因甲基化水平升高,TGF-β基因甲基化水平下调,而CNK1B(P27kip1)基因甲基化水平未发生明显变化。(5)慢病毒介导RNA干扰实验阻抑耐药细胞HOTAIR表达后,HOTAIR表达明显下调。MTT法检测siHOTAIR-SK-BR-3-TR细胞恢复了对曲妥珠单抗的敏感性。细胞增殖活性及侵袭能力减弱,细胞凋亡比例增加,qRT-PCR及WB检测细胞EMT相关基因及蛋白TGF-β、Snail及Vimentin表达下调,E-cadherin表达上调,HER2受体信号通路中HER2、PI3K、AKT、mTOR及MAPK表达水平及HER2磷酸化水平未发生明显改变,但p-AKT、p-MAPK及CyclinD1水平下调,而PTEN、P27水平上调。(6)MSP检测siHOTAIR-SK-BR-3-TR细胞PTEN基因甲基化水平下调,TGF-β基因甲基化水平上调,而CNK1B(P27kip1)基因甲基化水平无显著差异。(7)成功建立SK-BR-3-TS、SK-BR-3-TR和si-HOTAIR-SK-BR-3-TR裸鼠荷瘤模型。SK-BR-3-TR荷瘤模型瘤体生长速度较SK-BR-3-TS和si-HOTAIR-SK-BR-3-TR模型明显增快,差异具有统计学意义(P.05)。si-HOTAIR-SK-BR-3-TR模型瘤体TGF-β和Snail蛋白阳性表达率(1/6,16.7%；2/6,33.3%)低于SK-BR-3-TR(4/6,66.7%; 5/6,83.3%),但差异无统计学意义(Chi-Square tests,Fisher's Exact Test, P=0.242); E-cadherin及PTEN蛋白阳性表达率较高,但无统计学差异(P=0.242)。Ki67的表达阳性率无差别(均为5/6,83.3%,p=1.000)。结论：曲妥珠单抗耐药细胞株SK-BR-3-TR中HOTAIR表达上调诱导的TGF-β去甲基化表观遗传修饰及PTEN基因甲基化效应,从而分别导致耐药细胞EMT及PI3K/AKT/mTOR通路内在活性增强。HAOTAIR的双重表观遗传调控机制可能参与了SK-BR-3-TR细胞对曲妥珠单抗耐药。靶向抑制HOTAIR表达可能逆转曲妥珠单抗耐药。
[Abstract]:Objective: To study and preliminarily explore the relationship between HOTAIR and the resistance of trastuzumab in breast cancer and its possible molecular mechanism. Methods: (1) select the breast cancer cell line SK-BR-3-TS, through the intermittent large dose impact and gradually increase the dose combination method, to induce the establishment of SK-BR-3-TR. (2) qRT-PCR of trastuzumab resistant cell line to detect SK-BR-3-T The expression of HOTAIR in S and SK-BR-3-TR cells, MTT method was used to detect the proliferation activity of two cell model tumor cells. Flow cytometry was used to detect cell apoptosis. Transwell invasion test was used to observe cell invasiveness. QRT-PCR and Western blot were used to detect epithelial mesenchymal transition (epithelial mesenchymal transition, EMT) related genes and protein beta The expression of Snail, Vimentin and E-cadherin as well as the activity of PI3K/AKT/mTOR and MEK/MAPK signaling pathway. (3) methylation specific PCR (Methylation-Specific PCR, MSP) detection of the methylation level of two cells TGF- beta, PTEN and CNK1B genes. (4) lentivirus transfection interference experiment blocking expression, reverse validation The relationship between R and resistance to trastuzumab and its molecular mechanism. (5) BALB/c nude mice were loaded with tumor model in nude mice, and the growth rate of three models of tumor body was observed in SK-BR-3-TS, SK-BR-3-TR and si-HOTAIR-SK-BR-3-TR nude mice. Immunohistochemistry technique was used to detect the expression level of TGF- beta, Snail and E-cadherin, PTEN, Ki67. The effect of HOTAIR on the resistance of trastuzumab was further verified. Results: (1) the expression level of HOT AIR RNA was significantly up-regulated (2.216 + 0.332 V 0.326 + 0.05, P=0.0006) in the successful induction and stabilization of breast cancer trastuzumab resistant cell line SK-BR-3-TR, compared with SK-BR-3-TS of trastuzumab sensitive cell strain (P=0.0006). (2) MTT method, Transwell invasion The results of the test and flow cytometry showed that the proliferation and invasion ability of drug-resistant cells were enhanced and apoptosis decreased compared with sensitive cells. (3) qRT-PCR and WB detection showed that the EMT related gene TGF- beta, Snail and Vimentin up regulation, E-cadherin expression down and HER in HER2 receptor signaling pathway were compared with sensitive cells. 2, PI3K, AK, mTOR and MAPK gene expression level and HER2 receptor phosphorylation level did not change significantly, but p-AKT, p-MAPK and CyclinD1 levels increased, and PTEN, P27 levels down. (4) MSP detection of drug resistance cell PTEN genes increased the level of methylated under the level of methylated gene, but the level of methylation of the gene was not significantly changed. (5 Lentivirus mediated RNA interference test inhibited the expression of HOTAIR in drug-resistant cells, the expression of HOTAIR was obviously down regulated by.MTT method and the sensitivity of siHOTAIR-SK-BR-3-TR cells to trastuzumab was restored. The cell proliferation activity and invasion ability were weakened, the proportion of cell apoptosis was increased. QRT-PCR and WB were used to detect EMT related genes and protein TGF- beta, Snail and Vime. The expression of ntin was down, and the expression of E-cadherin was up-regulated. The expression level of HER2, PI3K, AKT, mTOR and MAPK in the HER2 receptor signaling pathway and the level of HER2 phosphorylation were not significantly changed, but p-AKT, p-MAPK and CyclinD1 levels were down regulated. (6) the methylation of the gene was detected. There was no significant difference in the level of CNK1B (P27kip1) gene methylation. (7) successful establishment of SK-BR-3-TS, SK-BR-3-TR and si-HOTAIR-SK-BR-3-TR nude mice bearing tumor model.SK-BR-3-TR tumor model tumor growth speed was significantly faster than the SK-BR-3-TS and si-HOTAIR-SK-BR-3-TR model, the difference was statistically significant (P.05).Si-HOTAIR-SK-BR-3-TR model. The positive rate of TGF- beta and Snail protein (1/6,16.7%; 2/6,33.3%) was lower than SK-BR-3-TR (4/6,66.7%; 5/6,83.3%), but the difference was not statistically significant (Chi-Square tests, Fisher's Exact Test), but there was no difference in the positive rate of the protein (Chi-Square tests, Fisher's Exact Test). 83.3%, p=1.000) conclusion: TGF- beta demethylation epigenetic modification and PTEN gene methylation effect induced by the up regulation of HOTAIR expression in the resistant cell line SK-BR-3-TR of trastuzumab resistant cell line, which may lead to the double epigenetic regulation mechanism of the intrinsic activity enhancement.HAOTAIR in the EMT and PI3K/AKT/mTOR pathway of drug resistant cells, may be involved in SK-BR-3-TR Cells resistant to trastuzumab. Targeted inhibition of HOTAIR expression may reverse the resistance of trastuzumab.
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.9

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