IFN-α对骨髓间充质干细胞的调控作用及机制研究

发布时间：2018-07-05 06:34

  本文选题：干扰素α + 间充质干细胞　； 参考：《浙江大学》2015年博士论文

【摘要】：在慢性粒细胞白血病(chronic myelogenous leukemia, CML)治疗领域干扰素-α (IFN-α)已应用多年,但对其作用机制的研究一直没有停止。最新研究进展提示与伊马替尼单用相比,IFN-α的联合使用可显著提高CML病人的分子生物学缓解率和长期无病生存率,出现这一现象的可能机制是IFN-α对静止期白血病细胞的调控作用,骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs),对白血病细胞的庇护作用,是调控白血病细胞周期停滞、逃避药物杀伤的关键环节。因此本研究从MSCs的角度出发,探讨IFN-α对MSCs生物学功能的影响和机制,以及IFN-α在调控MSCs庇护慢粒白血病细胞过程中的作用。具体研究分为三个部分：(1)IFN-α调控MSCs生物学功能的作用研究,(2)IFN-α靶基因PML对MSCs增殖与成骨分化的作用研究,(3)IFN-α/PML信号轴在调控MSCs庇护慢粒白血病细胞过程中的作用研究,并探寻可能的潜在机制。 第一部分IFN-α调控MSCs生物学功能的作用研究 目的：探讨IFN-α对MSCs生物学功能的影响,并明确IFN-α靶基因PML在此过程中的作用 方法：在获得伦理委员会批准和志愿者知情同意后,我们取健康志愿者骨髓2-3m1,密度梯度离心法分离MSCs。细胞接受不同浓度的IFN-α处理3、7或14天,显微镜下观察细胞形态,流式细胞术检测细胞周期和凋亡。SA-β-gal染色方法分析细胞衰老情况。采用PCR和Western blot技术分析P53、P21、PML等的基因和蛋白表达水平。根据人PMLcDNA序列设计合成PML过表达质粒及干扰质粒,由慢病毒转染的方法改变MSCs中PML基因和蛋白的表达。免疫荧光技术对PML核定位进行检测。 结果：MSCs接受IFN-α处理3天时,细胞增殖无明显改变,IFN-α处理14天后,MSCs生长变慢,克隆形成能力显著下降,然而并未发现明显的细胞凋亡。细胞衰老检测显示IFN-α可诱导MSCs细胞衰老,并具有时间和浓度依赖性,同时伴随着PML基因和蛋白的表达升高。随后,对PML调控MSCs细胞衰老的作用进行检测,结果显示PML基因的表达升高可诱导MSCs细胞衰老,转染后第7天,PML过表达MSCs中,SA-β-gal染色阳性率显著高于正常和转染空载体的MSCs,(47.43±3.8%vs4.9±0.7%,5.97±±0.75%),荧光定量PCR检测PML过表达的MSCs中,P21及P53基因表达水平增高。采用RNA干扰技术下调MSCs中PML表达后，，IFN-α诱导的细胞衰老作用被抑制,经IFN-α (1000U/ml)处理7天后,与对照组相比,PML敲降后的MSCs中SA-β-gal阳性率降低(4.49±1.27%vs.17.26±1.44%),提示PML参与到IFN-α诱导的MSCs细胞衰老过程中。同时,在IFN-α诱导MSCs细胞衰老过程中发现,PML与P53蛋白的共定位增加,而PML基因表达被敲降后,则未发现明显的P53点状定位,提示IFN-α介导的PML的表达增强可促进P53蛋白定位于PML-NBs。。 结论：IFN-α可诱导MSCs细胞衰老,而PML在IFN-α诱导衰老过程中起着非常关键的作用。 第二部分PML调控MSCs生物学功能的作用研究 目的：本部分拟研究PML在MSCs增殖和成骨分化过程中的作用 方法：健康志愿者骨髓中分离培养MSCs, PCR、Western blot技术检测不同状态下MSCs中PML基因和蛋白的表达,免疫荧光技术检测细胞增殖和成骨分化过程中,PML的定位及分布。慢病毒转染方法改变MSCs中PML的表达。CCK-8检测细胞增殖,流式细胞术分析细胞周期和凋亡。诱导MSCs向成骨细胞分化,在诱导第7天或14天进行Von kossa染色及ALP活性检测。 结果：在MSCs细胞增殖过程中,PML基因和蛋白均可稳定表达,将MSCs诱导向成骨细胞分化过程中,ALP表达升高,伴随着PML基因的表达增强,免疫荧光检测显示成骨分化过程中PML-NBs变大,与对照组相比,分化过程中PML-NBs分布不均匀。慢病毒转染的方法增强MSCs中PML的表达后,细胞增殖被抑制,在过表达后第3天,与正常MSCs相比细胞增殖抑制率为20.57±4.18%,与转染空载体的MSCs相比,增殖抑制率为18.46±3.53%,差异有统计学意义。PML的过表达的MSCs中,未发现明显的细胞周期抑制,但当使用RNA干扰的方法下调MSCs中PML表达后,细胞处于S+G2/M期的比例明显增加。 将细胞诱导向成骨细胞分化,诱导第7天,Von kossa染色结果显示MSCs的钙沉积显著增多,与正常MSCs、转染空载体的MSCs相比,PML过表达的MSCs钙沉积增加最为明显。ALP活性检测趋势一致,在正常MSCs、转染空载体的MSCs与PML过表达的MSCs中,ALP活性分别为0.2±0.008，0.24±0.016以及0.39±0.019U/mg。随后我们对未诱导分化的细胞进行相关检测,结果显示即使在没有成骨诱导液作用下,PML过表达后的第7天,MSCs中染成棕黑色的细胞外基质钙盐沉积也明显增多,同时,与正常MSCs及转染了空载体的MSCs相比,PML过表达的MSCs中ALP活性有一定程度的增高(0.049±0.006vs0.028±0.005,0.024±0.005U/mg,P0.05),差异有统计学意义。同时,在未加成骨分化诱导液的情况下,PML过表达后的第7天,ALP的mRNA水平也有明显增强,当PML表达被敲降,ALP mRNA的表达水平也下降。结论：PML可抑制MSCs增殖,但促进其成骨分化。 第三部分IFN-∝/PML信号轴在调控MSCs庇护慢粒白血病细胞过程中的作用研究 目的：探讨IFN-a及其靶基因PML对MSCs庇护作用的调控。并通过全基因组表达谱分析,寻找潜在的可能机制。 方法：CML细胞株K562单独或与MSCs共培养,在共培养4小时时加入1μM伊马替尼,药物作用72小时后,流式细胞术进行细胞凋亡检测。全基因组表达谱分析正常MSCs,转染空载体MSCs及PML过表达的MSCs中的基因表达差异,寻找有意义的基因。 结果：K562细胞与MSCs共培养后增殖速度明显减慢,但细胞凋亡比例并未增加。当MSCs接受IFN-α (1000U/ml)或IM(1μM)预处理3天后,再与K562细胞共培养时,发现与IM处理组相比,IFN-α处理组共培养的K562细胞扩增速度较快,K562细胞计数明显高于IM组。随后,K562细胞单独培养组及与MSCs共培养组接受1州的伊马替尼处理,凋亡检测结果显示K562单独培养组在IM处理72小时后,细胞凋亡率为62.32±8.44%,而有MSCs共培养时,K562接受IM处理72小时后细胞凋亡率下降为33.15+7.78%,提示MSCs可保护K562逃避IM的杀伤。随后我们使用IFN-α处理3天的MSCs细胞继续研究发现,IFN-α处理后的MSCs对K562的保护作用下降,K562更易于被伊马替尼杀伤,与IFN-α处理过的MSCs共培养的K562细胞凋亡率为48.83±2.02%,高于对照组(33.15±±7.78%)。当改变MSCs中PML的表达后发现,MSCs中PML高表达组,共培养的K562细胞凋亡率为49.1±±5.03%,显著高于对照组(36.37+1.63%),而MSCs中PML表达下调后,K562凋亡率为35.15±±13.03%,低于对照组(41.18±±12.94%)。正反两方面的结果提示,PML可能参与了MSCs对慢粒白血病细胞保护过程。全基因组表达谱分析发现,与正常MSCs和转染空载体的MSCs相比,PML过表达后的MSCs中有357个基因有较明显改变,除了PML基因外,3个上调最显著的基因为IL-1p,IL-8及IBSP,下调最为显著的3个基因均为FGFR2。 结论：MSCs对慢粒细胞株K562有庇护作用,IFN-α处理后的MSCs对K562的庇护作用下降。改变MSCs中PML的表达,也可能影响MSCs的庇护作用,表现为PML表达增强时,MSCs对K562的庇护作用减弱,而PML表达下调时,MSCs对K562的庇护作用增强。
[Abstract]:In this study , the effects of IFN - 伪 on the biological function of MSCs and the role of IFN - 伪 in the treatment of chronic leukemia cells were investigated .

Study on the Biological Function of the First Part of IFN - 伪 Regulation ;

Objective : To investigate the effect of IFN - 伪 on the biological function of MSCs .

Methods : After obtaining EC approval and informed consent of volunteers , we isolated MSCs from healthy volunteers bone marrow 2 - 3m1 and density gradient centrifugation . The cells were treated with different concentrations of IFN - 伪 for 3 , 7 or 14 days . Cell morphology and flow cytometry were used to detect cell cycle and apoptosis .

Results : When MSCs were treated with IFN - 伪 for 3 days , the proliferation of MSCs was not changed significantly . After 14 days of IFN - 伪 treatment , the growth of MSCs increased slowly , and the expression level of PML gene and protein was increased . The results showed that the positive rate of PML gene was decreased ( 4.49 卤 1.27 % vs . 17.26 卤 1.44 % ) .

Conclusion : IFN - 伪 can induce the senescence of MSCs , and PML plays a very important role in the course of IFN - 伪 induced senescence .

Study on the Biological Function of the Second Part of PML Regulatory MSCs ;

Objective : To study the role of PML in the proliferation and osteogenic differentiation of MSCs .

Methods : MSCs were isolated from bone marrow of healthy volunteers . The expression of PML gene and protein in MSCs were detected by PCR and Western blot . The expression of PML in MSCs was detected by immunofluorescence technique . The expression of PML in MSCs was detected by slow virus transfection . CCK - 8 detected cell proliferation and flow cytometry analysis of cell cycle and apoptosis . After inducing MSCs to differentiate into osteoblasts , Von kossa staining and ALP activity were detected on day 7 or 14 days .

Results : In the process of MSCs ' proliferation , PML gene and protein were stably expressed , and the expression of PML - NBs was increased during the differentiation of MSCs . The proliferation inhibition rate of PML - NBs was 20.57 卤 4.18 % , compared with the control group . The proliferation inhibition rate was 18.46 卤 3.53 % .

Compared with normal MSCs and MSCs transfected with empty vector , ALP activity increased significantly ( 0.049 卤 0.006 vs 0.028 卤 0.005 , 0 . 024 卤 0.005U / mg , P0.05 ) .

Study on the Role of the Third Part of IFN - & lt ; & gt ; & lt ; & gt ; / PML Signal Axis in the Regulation and Control of the Slow - grained Leukemia Cells of MSCs

Objective : To investigate the role of IFN - a and its target gene PML in the asylum of MSCs .

Methods : CML cell line K562 was cultured in vitro or co - cultured with MSCs . After co - culture for 4 hours , 1 渭M imatinib was added . After 72 hours of drug action , flow cytometry was performed to detect apoptosis .

Results : After treated with IFN - 伪 ( 1000U / ml ) or IM ( 1 渭M ) for 3 days , the apoptosis rate of K562 cells was significantly higher than that in control group ( 33.15 卤 8.44 % ) .

Conclusion : MSCs have a protective effect on K562 cells , and the effect of MSCs on K562 is decreased after IFN - 伪 treatment .
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R733.7

【共引文献】

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本文编号：2099310