CFTR在上皮性卵巢癌侵袭转移的作用及机制研究

发布时间：2018-07-15 22:40

【摘要】：卵巢癌是女性生殖系统中最常见的恶性肿瘤之一。在卵巢癌中,最为常见的病理类型是上皮性卵巢癌。在发达国家,上皮性卵巢癌是致死率最高的妇科肿瘤,超过70%的妇女在被诊断时就已经是晚期,而晚期卵巢癌的治愈率不高于30%。上皮性卵巢癌的治疗效果不佳,与其在诊断之前肿瘤的早期侵袭和转移有关。到目前为止,上皮性卵巢癌转移的机制仍然不完全清楚。所以寻找上皮性卵巢癌转移的分子标志物,研究其转移机制,一直是卵巢癌研究中的热点。囊性纤维化跨膜转导因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR)是一个约170 kDa的糖蛋白,是一个环磷酸腺苷依赖的氯离子通道蛋白。CFTR分布于人类各组织的上皮细胞,包括女性生殖道,通过调控离子和水分转运,在维持和稳定机体局部液体微环境稳态中发挥重要作用。CFTR是ABC (ATP-binding cassette)转运蛋白家族的一员,它们利用ATP酶转运底物通过细胞膜,这与多种恶性肿瘤的发生发展有密切关系。CFTR的基因突变可以导致其在细胞膜上转运功能的障碍,可能增加或减少一些恶性肿瘤患病风险。有研究表明,CFTR与乳腺癌的上皮向间质转化有关。CFTR也与一些细胞炎症和凋亡相关的信号通路有关。国内外目前尚无CFTR在上皮性卵巢癌恶性生物学行为中的相关研究报道。因此,本课题将分为以下三部分对CFTR在上皮性卵巢癌侵袭转移的作用及其潜在的机制进行初步研究。第一部分CFTR在人上皮性卵巢癌中的表达及与临床病理参数的相关性目的：检测人上皮性卵巢癌组织、良性卵巢组织及正常卵巢组织标本中CFTR的蛋白表达情况,探讨上皮性卵巢癌组织中CFTR的表达与临床病理参数之间的相关性。方法：(1)采用免疫组织化学法检测CFTR在83例上皮性卵巢癌组织标本,18例良性肿瘤标本和11例正常卵巢组织标本中的表达情况。(2)分析CFTR的表达与临床病理参数之间的关系。结果：免疫组织化学结果显示,CFTR在上皮性卵巢癌组织中的表达比良性卵巢肿瘤组(PO.05)以及正常卵巢组(P0.05)均明显增高,差异均有统计学意义,而良性卵巢肿瘤和正常卵巢组间差异无统计学意义(P0.05)。在上皮性卵巢癌中,CFTR蛋白的表达水平在FIGO Ⅲ/Ⅳ期组织中显著高于Ⅰ/Ⅱ期(P0.05),病理分级2-3级组织中的表达显著高于1级(P0.05),血浆Ca-12535 U/ml的组织中表达显著高于Ca-12535 U/ml的组织(P0.05),但与患者年龄、肿瘤大小、血浆HE4水平无关(P0.05)。在各个病理类型中,浆液性囊腺癌中CFTR的表达水平比粘液性囊腺癌(P0.05)和子宫内膜样癌(P0.05)高,差异具有统计学意义。结论：在上皮性卵巢癌组织中CFTR高表达。高水平的CFTR与上皮性卵巢癌分期、肿瘤分化、血浆Ca-125值有关,CFTR的高表达可能与临床不良预后有关。卵巢浆液性囊腺癌组织中的CFTR表达水平比其他病理类型高,这说明CFTR可能在浆液性囊腺癌的发生发展中起重要作用。第二部分CFTR基因特异性shRNA稳定转染上皮性卵巢癌细胞株的筛选及人CFTR基因重组腺病毒的包装及鉴定目的：应用人CFTR基因特异性短发卡RNA (shRNA)真核质粒表达载体转染卵巢癌细胞,通过嘌呤霉素筛选,建立稳定转染的卵巢癌细胞株,并检测验证。构建包含人CFTR基因的重组腺病毒真核表达载体,使用HEK293细胞包装重组腺病毒。利用稳定转染卵巢癌细胞株和重组腺病毒,为后续研究奠定实验基础。方法：质粒转化大肠杆菌法扩增CFTR基因特异性shRNA表达质粒,并酶切鉴定。将shRNA质粒通过PolyJetTM转染到A2780、 SKOV3细胞中,对转染后细胞进行嘌呤霉素加压筛选,荧光显微镜观察后,挑选克隆,扩大培养,直至建立稳定转染细胞株。采用Western blot法分别检测转染组、阴性对照组及未转染组细胞中CFTR蛋白表达量的变化,验证和筛选CFTR基因抑制效应最显著的稳定转染细胞株。将目的片段人CFTR基因经酶切、分离、纯化,构建pAdTrace-CFTR-TOX质粒并酶切及测序鉴定。利用BJ5183细菌行质粒pAdTrace-CFTR的同源重组,然后酶切及PCR法鉴定。将同源重组质粒pAdTrace-CFTR线性化后转染HEK293细胞,进行病毒的包装和扩增。乒乓感染法制备高滴度Ad-CFTR腺病毒。Western blot检测病毒感染后卵巢癌细胞CFTR蛋白表达水平。结果：经酶切验证,成功扩增CFTR特异性shRNA表达质粒。将CFTR-shRNA-1, CFTR-shRNA-2, CFTR-shRNA-3, CFTR-shRNA-4和阴性对照成功转染A278、SKOV3细胞,嘌呤霉素霉素加压筛选获得稳定表达的单克隆细胞株。荧光显微镜观察细胞克隆的GFP表达,成功验证和筛选有均匀GFP荧光的细胞克隆。通过Western blot法检测CFTR蛋白表达,验证和筛选CFTR基因抑制效果最显著的稳定转染上皮性卵巢癌细胞株A2780-CFTRi2和SKOV3-CFTRi3细胞。经酶切后琼脂糖电泳鉴定表明目的人CFTR基因分离成功。经酶切后琼脂糖电泳及基因测序表明重组质粒pAdTrace-CFTR-TOX构建成功。经酶切后琼脂糖电泳、PCR法检测表明同源重组质粒pAdTrace-CFTR构建成功。经荧光显微镜观察HEK293细胞中的RFP表达,表明Ad-CFTR腺病毒包装及扩增成功。荧光显微镜观察Ad-CFTR腺病毒感染卵巢癌细胞效率,western blot分析表明腺病毒Ad-CFTR感染后细胞CFTR蛋白表达增加,说明重组腺病毒Ad-CFTR构建成功。结论：成功扩增和鉴定了CFTR基因的特异性重组质粒。利用细胞转染和嘌呤霉素筛选成功获得了CFTR基因抑制效果最显著的稳定转染上皮性卵巢癌细胞株。成功构建重组腺病毒真核表达载体pAdTrace-CFTR-TOX,利用pAdEasy系统成功包装获得过表达人CFTR基因的腺病毒,为进一步研究CFTR恶性生物学行为及其分子机制奠定了实验基础。第三部分CFTR参与调节上皮性卵巢癌细胞侵袭转移行为及机制的实验研究目的：探讨CFTR对卵巢癌A2780、SKOV3细胞侵袭、迁移、增殖和粘附等一系列恶性生物学行为的影响及其可能分子机制。方法:Transwell小室实验检测CFTRi细胞的迁移、侵袭能力变化。划痕实验检测CFTR过表达细胞迁移能力的变化。细胞粘附实验分析CFTRi细胞的粘附能力改变。细胞增殖实验测定CFTRi细胞增殖能力改变。平板克隆形成实验观察CFTRi细胞的克隆形成能力变化。裸鼠皮下移成瘤实验观察CFTRi细胞体内成瘤能力变化,HE染色观察裸鼠移植瘤组织形态学变化。重组腺病毒Ad-CFTR感染卵巢癌细胞A2780. SKOV3后,Western blot法检测细胞src通路蛋白表达及其磷酸化形式的水平变化。结果：(1) Transwell、室迁移实验结果表明,CFTRi细胞的迁移能力受到抑制。与对照组相比,约有63.11%的A2780-CFTRi细胞未能穿过基膜。而SKOV3-CFTRi细胞与对照组细胞相比,迁移能力减少了41.72%。(2) Transwell小室侵袭实验结果显示,CFTRi细胞的侵袭能力受到抑制。与对照组相比,约有63.93%的A2780-CFTRi细胞未能穿过基膜。而SKOV3-CFTRi细胞与对照组细胞相比,侵袭能力减少了60.89%。(3)细胞划痕实验结果表明,Ad-CFTR感染后细胞迁移能力增加。A2780-Ad-CFTR组比对照组迁移能力增加了39.5%,同样的,SKOV3-Ad-CFTR组迁移程度比对照组增加39.3%。(4)细胞粘附实验显示,CFTRi细胞的粘附能力显著降低。A2780-CFTRi细胞株粘附能力降低了约38.52%,而SKOV3-CFTRi粘附能力减少了42.31%。(5)细胞增殖实验显示出了CFTRi细胞增殖能力的降低。A2780-CFTRi和SKOV3-CFTRi细胞与对照组细胞相比均表现出增殖能力的降低。(6)平板克隆形成实验表明,CFTRi表现出克隆形成能力的降低。A2780-CFTRi和SKOV3-CFTRi细胞与对照组细胞相比均表现出克隆形成能力的降低。(7)裸鼠皮下移成瘤实验发现,CFTRi细胞移植瘤瘤体生长速度缓慢,体积减小,移植瘤重量减少。HE染色发现CFTRi组移植瘤细胞排列相对整齐。(8)各组细胞总的c-Src和磷酸化-Src419(Tyr419)表达量的变化均没有统计学意义,CFTR过表达的组细胞表现出了磷酸化-Src530 (Tyr530)的激活。结论：CFTRi卵巢癌细胞表现出了细胞的侵袭转移能力、增殖能力、克隆形成能力和体内成瘤能力的显著抑制,Ad-CFTR感染后细胞表现出了迁移能力的增加,从正反两方面证实了CFTR在上皮性卵巢癌侵袭迁移、增殖、克隆形成等恶性生物学行为中的作用。在上皮性卵巢癌细胞中,上调的CFTR可能间接通过EBP50-Cbp-Csk影响到Tyr-527/530位点的磷酸化,从而影响侵袭、迁移等一系列恶性生物学行为。CFTR有可能是src信号转导通路潜在的调节因子。
[Abstract]:Ovarian cancer is one of the most common malignant tumors in the female reproductive system . In the developed countries , the most common pathological type is epithelial ovarian cancer . In developed countries , epithelial ovarian cancer is the most lethal gynecological tumor , and more than 70 % of them are involved in the development of ovarian cancer . The expression level of CFTR protein in ovarian serous cystadenocarcinoma was significantly higher than that in benign ovarian tumor group ( P0.05 ) . The expression of CFTR gene was successfully amplified and screened . The results showed that the expression of CFTR gene was successful . Compared with the control group , the ability of migration of CFTRi cells decreased by 39.3 % . Conclusion : CFTR may indirectly affect the invasion , proliferation and clonal formation of epithelial ovarian carcinoma . In the epithelial ovarian cancer cells , the up - regulated CFTR may indirectly affect the phosphorylation of Tyr - 527 / 530 sites by EBP50 - Cbp - Csk .
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.31

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