microRNA结合位点单核苷酸多态性对肝细胞癌预后影响的相关性研究

发布时间：2018-07-15 22:17

【摘要】：肝细胞癌(hepatocelluar carcinoma,HCC)是全球发病率排名第五的一种常见恶性肿瘤,每年超过五十万人死于HCC,它也是世界上死亡发生率位列癌症第三的肿瘤,严重威胁着人们的身体健康。流行病学及实验研究资料表明,HCC与许多危险因素密切相关,包括慢性乙型肝炎病毒和慢性丙型肝炎病毒感染、酗酒、亚硝胺类物质、黄曲霉素、肝硬化、饮水污染、微量元素、性激素等都与HCC发病明显相关。由于HCC发生的分子机制尚不完全清楚,尽管临床检测方法和治疗手段不断的改进与发展,但是化疗及术后HCC患者的预后仍然很差,复发率高,其中有许多影响预后的相关因素,包括肿瘤大小,肿瘤数量,细胞分化,对静脉血管侵袭及炎症程度等。恶性肿瘤是在多个危险因素的共同作用下,导致人体组织细胞分裂、增生、凋亡等调控异常而形成的一种新生物。基因组表达的不稳定性是恶性肿瘤发病的基本特征之一,基因组的缺失或扩增常常在恶性肿瘤的发生、发展过程中出现,这些基因组的改变可导致抑癌基因的失活或癌基因的激活,使人体细胞出现重大的改变。大约有50%的微小核糖核酸(microRNAs,miRNAs)基因位于与恶性肿瘤相关的脆性位点或基因组区域,它们和正常人体组织细胞miRNA的表达有明显差异,不同组织来源的肿瘤细胞系中的miRNA的调控作用及含量也会明显不同。miRNAs是近年来发现的一类由22个核苷酸组成,可以通过与信使核糖核酸(messenger RNA,mRNA)3′非编码区(3'-untranslated region,3'UTR)碱基互补结合,导致其目的蛋白翻译受到抑制,发挥其转录后调节器的作用。具体来说,miRNA的目标核苷酸位于mRNA的5'端,也被称为mRNA 3'UTR的种子区域。miRNA与其相应mRNA序列的互补结合导致mRNA沉默并进而促使目的蛋白表达水平的下降,可以影响细胞发育、分化、增殖、凋亡等多种生物学过程。miRNA是一个细胞功能和细胞程序的调控阀门,不仅能调节多种蛋白质的表达,还能影响多个信号通路的信号传导,对恶性肿瘤的发生发展过程具有调控枢纽作用。近年来许多学者越来越重视mirna相关等位基因单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms,snps)的研究。snps是指单个核苷酸在染色体水平上变异而引起的基因组序列多态性,这些变异包括核苷酸的置换、缺失和插入等改变。snps广泛存在于人类基因组中,平均每500~1000个碱基就会出现一个,占所有已知基因多态性类型的90%以上,是人类最常见的一种可遗传变异。随着对人类全基因组大规模扫描结果显示,mirna结合位点上的snps约有20000个。它既具有遗传标记作用,还可以通过调控基因表达导致疾病易感性的差异。越来越多的证据表明,位于3'utr的mirna结合位点snps可以通过mirna改变目的基因的表达,从而增加个体罹患癌症的风险。mirna及其结合位点snps对hcc的发病易感性,肿瘤细胞的转移,疾病的自然转归及术后预后有明显的影响,而且部分snps可以抑制肿瘤细胞增殖,对机体有保护作用。mirna结合位点snps分析可以帮助我们确定hcc患者亚组中的发病风险和治疗预后。为此,本实验将筛选hcc患者位于靶基因3′utr的4个mirna结合位点snps,包括兰尼碱受体3(ryanodinereceptor3,ryr3)(rs1044129),c14orf101(rs4901706),kiaa0423(rs1053667)和golga7(rs11337),了解它们与hcc患病风险和预后的关系,评估其在hcc患者发生发展中的作用。第一部分肝细胞癌患者microrna结合位点单核苷酸多态性的筛选与鉴定目的:本实验拟结合文献,并通过ncbidbsnp数据库公布的3'utrmirna结合位点snps,筛选出可能影响hcc患者发病及预后的基因位点,为hcc的精准治疗奠定良好的基础。方法:1)收集从2008年1月到2010年12月河北医科大学第二医院肝胆外科连续95例接受hcc切除术并经病理证实的hcc患者的血液样本。对照组:选择同期在我院体检中心查体的90例无癌症病史的健康对照血液标本。所有实验均获得所有患者同意并经医院伦理委员会监督批准。2)收集上述hcc患者的临床资料。临床数据包括性别、年龄、child-pugh分级、门静脉瘤栓是否形成、肿瘤数量、肿瘤直径和tnm分期等。对hcc术后患者通过电话对其随访,如病重或死亡则对其家属进行随访,以了解患者生存情况,随访时间为3年。3)统计上述临床资料hcc患者术后3年存活率之间的差异,并统计出可能影响生存率的相关因素。应用dna纯化试剂盒对hcc患者全血基因组dna进行提取并提纯。根据ncbi数据库查找到的上述4个mirna结合位点snps相应的核苷酸序列,设计出pcr扩增所需上下游引物,并按照pcrmastermixkit流程扩增上述基因,采用snapshot方法鉴定各snps基因型。4)统计学方法:对hcc组和正常对照组的性别、年龄等计量资料进行比较均采用t检验(studentt-test),分析hcc和对照组snp分布频率采用χ2检验(pearsonchi-squaretest)进行分析,估计组间生存率和绘制累计生存函数曲线采用kaplan-meier方法,检验各组生存曲线分布的异同,比较生存率有无差别应用log-rank方法,多因素生存分析采用cox比例风险模型进行。不同组间比较均采用t检验分析数据。所有统计数据均应用spss18.0统计软件进行数据分析,p0.05表示差异有显著性。结果:1)研究对象:对hcc组与对照组的年龄、性别进行比较,结果显示两组年龄(58.74±12.58vs56.83±9.80,p=0.853)、性别(84/11vs81/9,p=0.730)均衡可比,差异无统计学意义。各临床特征的术后3年生存率如下:男性vs女性(31.6%vs22.2%,p=0.530),年龄≤60岁vs60岁(28.8%vs34.5%,p=0.742),child-pugh分级a级vsb级(32.9%vs0%,p=0.019),门静脉瘤栓形成vs无瘤栓形成(32.5%vs12.5%,p=0.027),肿瘤直径(单位厘米)≤5vs5(35.7%vs28.3%,p=0.765),tnm分期0~ⅠvsⅡ~Ⅲ(46.7%vs22.4%,p=0.017),单发肿瘤vs多发肿瘤(30.9%vs30.0%,p=0.871)。2)mirna结合位点snp分布频率分析:对hcc组和正常对照组的4个mirna结合位点snps分布频率分析显示,所有4个snps,rs1044129、rs4901706、rs1053667、rs11337,分布频率均无显著性差异,说明实验所筛选各snp位点可能都与hcc发病无明显相关。3)生存分析:分析hcc患者术后3年生存率结果显示,ryr3基因结合位点rs1044129,aa基因型vsag+gg(39.4%vs25.5%,p=0.047);c14orf101基因结合位点rs4901706,gg基因型vsaa+ag(27.1%vs35.0%,p=0.573);kiaa0423基因结合位点rs1053667,tt基因型vsct+cc(32.8%vs26.7%,p=0.717);golga7基因结合位点rs11337,gg基因型vsgt+tt(30.8%vs30.6%,p=0.594)。我们应用cox比例风险模型对这些预测因素进行了多变量分析,结果显示,ryr3相对危险度为1.812(95%可信区间:1.026~3.201,p=0.041),child-pugh分级相对危险度为2.464(95%可信区间:1.020~5.951,p=0.045),tnm分期相对危险度为1.922(95%可信区间:1.037~3.562,p=0.038),门静脉瘤栓形成相对危险度为1.571(95%可信区间:0.664~3.719,p=0.304)。第二部分ryr3基因microrna结合位点单核苷酸多态性与术后hcc患者预后的关系目的:本部分研究,我们将对位于3′utrryr3基因mirna结合位点rs1044129各基因型在hcc患者组织中的表达进行分析,并且通过hela细胞转染目的基因了解其对癌细胞活性的影响,以此评估rs1044129与hcc预后的关系。方法:1)对象来源:病例组选择88例接受原发性肝癌切除术并经病理证实的hcc患者。对照组选择45例同时期因肝脏海绵状血管瘤、肝内胆管结石以及其它肝脏良性疾病进行手术治疗的患者,留取各试验组肝脏组织。2)hcc患者全血基因组dna提取,目的基因pcr扩增及基因型分析,同第一部分。3)免疫组织化学方法检测ryr3在肝脏组织的定位表达,应用组织化学评分方法对实验结果判定。4)根据ryr3的核苷酸序列设计出含有aa或gg基因型的2条寡核苷酸链的正义,反义引物链,构建质粒并转染hela细胞,应用psichecktm-2载体检测转染ryr3基因对hela细胞系细胞活性的影响。5)统计学方法:分析ryr3组各基因型在hcc组织表达情况采用χ2检验,采用kaplan-meier检验比较ryr3低表达与高表达hcc患者的术后生存率,采用t检验比较组间不同的荧光素酶基因表达水平。所有数据分析均使用spss18.0统计软件包处理,p0.05表示差异有显著性。结果:1)我们应用免疫组织化学方法检测了收集的88例hcc组织ryr3表达情况并计算相应的组织化学评分。hcc患者ryr3(rs1044129)aa型低表达vs高表达(29例vs4例),ag型低表达vs高表达(8例vs33例),gg型低表达vs高表达(3例vs11例)。χ2检验显示,ryr3aa基因型的hcc患者,比ag和gg型患者表达水平更低,与二者比较均有显著性差异(p=0.001)。2)hcc肝组织ryr3(rs1044129)低表达患者人数vs高表达(40例vs48例),术后3年生存率低表达患者vs高表达(54.91vs27.45,p=0.032)。3)应用含有aa或gg基因型寡核苷酸链的质粒转染hela细胞后,我们观察到海肾荧光素酶活性与萤火虫荧光素酶活性比aa基因型vsgg(1.61±0.09vs2.01±0.14,p=0.019)。第三部分ryr3基因microrna结合位点单核苷酸多态性对人肝癌细胞系smmc-7721细胞功能的影响目的:本部分应用人肝癌细胞系smmc-7721作为研究对象,采用小干扰rna技术沉默ryr3在肝细胞癌smmc-7721细胞中的表达,观察转染ryr3sirna后肝细胞癌smmc-7721细胞增殖与凋亡的变化,了解位于ryr3基因mirna结合位点rs1044129对肝癌细胞功能的影响,以此证实其对hcc患者预后的影响。方法:1)我们以psi-u6为载体构建ryr3敲低质粒,合成4对候选ryr3-shrna和1对阴性对照nc-shrna。制备感受态大肠埃希菌,并进行质粒转化及提取,应用质粒和lipofectamine2000混合液转染人肝癌细胞系smmc-7721细胞,经过培养后倒置显微镜下观察到培养的肝癌细胞出现绿色荧光,证明细胞转染成功。将实验细胞分为3组,正常对照组(blank-control),阴性对照转染组(control-sirna/lipofactamine2000)和实验组(ryr3-sirna/lipofactamine2000)。2)westernblot方法筛选出ryr3沉默最佳的人肝癌细胞系smmc-7721细胞进行后续的实验。3)mts法检测转染ryr3基因后对人肝癌细胞系smmc-7721细胞增殖的影响。4)应用流式细胞仪检测转染ryr3基因后对人肝癌细胞系smmc-7721细胞凋亡的影响。5)统计学方法:评估blank-control和control-sirna与ryr3转染组的差异采用两独立样本t检验,所有数据分析均使用spss18.0统计软件包处理,p0.05被认为有统计学意义。结果:1)质粒转染人肝癌细胞系smmc-7721细胞后,培养48h后通过倒置荧光显微镜在激发波长480nm条件下检测转染细胞,镜下可见肝癌细胞表达gfp绿色荧光,转染效率达到91%。2)应用westernblot检测smmc-7721细胞结果显示:转染48h后,sirna-1,sirna-2,sirna-3和sirna-4均有效降低smmc-7721细胞内源ryr3蛋白的表达水平,与对照组相比分别降低了48.6%、54.7%、36.9%和38.2%。因此,选取沉默最佳的sirna-2用于后续的细胞功能实验。3)应用mts法检测人肝癌细胞系SMMC-7721细胞转染RYR3-siRNA基因后0 h,12 h,24 h,36 h,48 h,60 h,72 h的吸光值(OD)。研究结果显示,RYR3-siRNA组的OD值分别为0.867±0.010、1.184±0.059、1.441±0.082、1.659±0.102、1.744±0.065、1.862±0.033、1.998±0.093;Control-siRNA组分别为0.868±0.080、1.327±0.052、1.837±0.076、2.220±0.138、2.449±0.072、2.535±0.035、2.613±0.176;Blank-control组0.863±0.107、1.568±0.131、1.919±0.059、2.554±0.082、2.715±0.078、2.804±0.112、2.986±0.086。在各观察时段SMMC-7721细胞生长均出现不同程度的抑制,且抑制率随转染后培养时间的延长而增加,各时间段比较有显著性差异,且与Control-siRNA组和Blank-control组也有显著性差异(P0.05)。4)转染RYR3对人肝癌细胞系SMMC-7721细胞凋亡的影响:通过流式细胞仪检测转染后肝癌细胞凋亡率可见,转染后肝癌细胞RYR3-siRNA组凋亡率为39.010±1.677,Control-siRNA组为12.379±1.075,Blank-control组为5.373±0.456,RYR3-siRNA组凋亡率与其余2组凋亡率相比明显下降,结果均有显著性差异(P0.05)。结论:1)筛选与HCC术后三年生存率相关的临床特征和4个miRNA结合位点SNPs发现,Child-Pugh分级、TNM分期、RYR3(rs1044129)与HCC术后3年生存率明显相关。2)HCC患者rs1044129 AA型肝组织中RYR3表达较其它类型减少最为明显,RYR3低表达患者生存时间比高表达患者明显延长,RYR3转染HeLa细胞后其细胞活性AA型比GG型降低更为明显。3)RYR3(rs1044129)沉默可抑制SMMC-7721肝癌细胞增殖并诱导其细胞凋亡。总之,本课题研究表明,位于3'UTR的RYR3 miRNA结合位点rs1044129 SNP通过影响miRNA与RYR3的结合力而影响RYR3表达,继而RYR3通过对肝癌细胞增殖、凋亡的影响来调控HCC预后,RYR3可以作为一个独立的生物标记物来预测HCC的预后。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7

【参考文献】