巨噬细胞诱导乳腺癌细胞自噬的分子机制研究

发布时间：2018-07-23 14:51

【摘要】：第一部分乳腺癌组织中巨噬细胞及自噬标志物的表达相关性及临床意义目的:在乳腺癌组织芯片中检测巨噬细胞(CD68)蛋白表达水平、自噬标志物LC3B蛋白表达水平,从而分析两者之间的相关性;并结合乳腺癌标本的临床数据探讨其临床意义。方法:在含有160例乳腺癌组织的组织芯片中运用免疫组织荧光双染法,检测巨噬细胞(CD68标记)、以及自噬标志物LC3B的表达情况。采用皮尔森相关系数分析CD68与LC3B在临床标本中表达的相关性,Kaplan-Meier生存分析用于评价CD68和LC3B对总体生存率的影响;采用Cox回归模型分析CD68、LC3B对预后影响的风险比和独立性。结果:测得乳腺癌组织中CD68的平均光密度值为0.151297±0.0491mm-2,CD68高表达组(大于平均光密度值)在临床分期Ⅲ期、Ⅱ-Ⅲ级、Ⅱ级的数量明显高于CD68低表达组(p=0.016),但是两组在肿瘤大小、患者年龄、淋巴结转移、TNM分期以及乳腺癌分子分型中分的布无显著性差异(p0.05)。乳腺癌组织中LC3B单位面积平均光密度值为0.16300974±0.0438mm-2,LC3B高表达组(大于平均光密度值)在三阴性乳腺癌表达的数量明显高于LC3B低表达组(p=0.016),两组在乳腺癌临床分期、患者年龄、TNM分期、肿瘤大小以及淋巴结转移中的分布无显著性差异(p0.05)。相关性分析结果显示CD68与LC3B表达呈正相关(r=0.327,p0.001)。高表达的CD68可显著降低患者10年总体生存率(p=0.002),对5年总体生存率影响无显著性差异(p=0.067),高表达的LC3B可显著降低患者5年、10年总体生存率(p=0.042、p=0.001),Cox回归分析结果得出LC3B的风险比为4.142,可以被看作为乳腺癌独立预测指标之一(p=0.011)。结论:乳腺癌中巨噬细胞表达量与自噬相关;巨噬细胞和自噬与乳腺癌病人的总体生存率密切相关,LC3B可作为判断乳腺癌病人不良预后的指标之一。第二部分巨噬细胞对乳腺癌细胞自噬及化疗敏感性的影响目的:证实巨噬细胞促进乳腺癌自噬及观察其对乳腺癌细胞化疗敏感性的影响。方法:Western blot检测与巨噬细胞共培养不同时间点的乳腺癌细胞自噬情况,运用自噬抑制剂CQ,使用si-RNA敲除乳腺癌细胞株中Beclin1、Atg7基因,检测LC3B变化情况。乳腺癌细胞感染GFP-RFP-LC3腺病毒,共聚焦显微镜记录巨噬细胞作用后乳腺癌细胞中形成自噬体。体外刺激人单核细胞株THP-1细胞贴壁成为巨噬细胞,与乳腺癌细胞株MDA-MB-468及MCF-7共培养,同时加用紫杉醇(TAX),及自噬抑制剂CQ,流式测量各组凋亡情况。体内实验部分采用4T1细胞,4T1和RAW 264.7(M?)对BABL/c雌性小鼠进行异种种植,小鼠成瘤后注射紫杉醇三周,观测各组移植瘤瘤重的情况;免疫组织化学检测小鼠瘤石蜡切片中的LC3B表达情况。结果:Western blot结果显示,与对照组相比巨噬细胞刺激的的乳腺癌细胞中LC3B明显升高。运用药物CQ抑制自噬潮,明显增加乳腺癌细胞中LC3B含量。从基因层面,敲除乳腺癌中Beclin1、Atg7后,巨噬细胞对乳腺癌细胞自噬的激活作用明显减弱。巨噬细胞作用乳腺癌16 h后,共聚焦显微镜记录自噬体明显增加。应用紫杉醇后,与巨噬细胞共培养的MDA-MB-468及MCF-7细胞凋亡率较单独培养组明显减少,加入CQ抑制巨噬细胞引起的自噬可明显增加乳腺癌细胞对TAX的敏感性,凋亡明显增加(p0.001)。体内实验中,紫杉醇明显缩小4T1组的肿瘤大小,对4T1+M?组作用不明显。在小鼠瘤石蜡切片中4T1+M?组LC3B表达量较4T1组多,分布广泛。结论:巨噬细胞能够诱导乳腺癌细胞发生自噬,降低紫杉醇诱导的乳腺癌细胞凋亡;体内实验中巨噬细可降低乳腺癌对紫杉醇的敏感性。第三部分巨噬细胞诱导乳腺癌细胞自噬分子机制研究目的:探讨巨噬细胞促进乳腺癌细胞自噬的分子机制。方法:细胞因子芯片筛选巨噬细胞所分泌的可能发挥作用的细胞因子,用ELLISA进一步验证细胞因子的分泌情况。运用si-RNA技术敲除巨噬细胞中筛选的细胞因子,与乳腺癌细胞共培养后检测自噬变化情况;同时运用外源性小分子合成物及细胞因子拮抗剂拮抗,检测其对乳腺癌细胞自噬变化情况。检测MAPK信号通路的激活情况,使用ERK通路抑制剂U0126抑制ERK、JNK通路抑制剂SP600125抑制JNK、p38信号通路抑制剂SB203580抑制p38表达后,观察LC3B的表达情况,免疫组化检测小鼠石蜡切片中被筛选出细胞因子表达情况。结果:采用细胞因子芯片筛选,发现巨噬细胞能够分泌大量MIP-3α、MCP-3、ENA-78,其可能在巨噬细胞促进乳腺癌细胞自噬发挥作用。使用si-MIP-3α、si-ENA-78、si-MCP-3分别敲除巨噬细胞中这些细胞因子,敲除MIP-3α的巨噬细胞对乳腺癌细胞自噬的激活作用明显减弱。分别加入MIP-3α、MCP-3、ENA-78外源性小分子合成物,其中加入MIP-3α的乳腺癌细胞中LC3B表达量上调,余无明显变化;MIP-3α的拮抗剂作用巨噬细胞刺激的乳腺癌细胞,LC3B的表达量明显减弱。Western blot结果显示巨噬细胞上调LC3B表达的同时伴随MAPK信号通路的激活。运用ERK抑制剂U0126后,LC3B表达明显减弱,而运用JNK抑制剂SP600125和p38抑制剂SB203580,LC3B变化不明显,敲除巨噬细胞中MIP-3α后,其对乳腺癌细胞ERK激活作用减弱,在小鼠瘤石蜡切片中4T1+M?组MIP-3α表达量较4T1组明显增多。结论:巨噬细胞可通过分泌MIP-3α,进而激活乳腺癌细胞中ERK通路,促进乳腺癌细胞自噬。
[Abstract]:The expression of CD68 and LC3B in breast cancer tissue was significantly higher than that in LC3B low expression group ( p = 0 . 016 ) . The correlation analysis showed that CD68 had positive correlation with LC3B expression ( r = 0 . 327 , p . 001 ) . The effect of macrophages and autophagy on the chemosensitivity of breast cancer cells was observed by Western blot . Western blot showed that macrophages were able to secrete large amounts of MIP - 3伪 , MCP - 3 , IL - 78 .
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.9

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