食管鳞癌中lncRNA TP73-AS1表达及对增殖和凋亡的影响

发布时间：2018-09-07 19:19

【摘要】：背景和目的食管癌(esophageal carcinoma,EC)是一种高度恶性的消化道肿瘤,有2种重要类型:食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EAC)和食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell cancer,ESCC),食管腺癌在西方国家比较多见,食管鳞状细胞癌在发展中国家更流行。河南林州是食管癌的高发区,占当地全部恶性肿瘤的81.4%。目前,外科手术治疗是治疗早期食管癌的首选方法,但很多中晚期患者确诊时已失去手术治疗的机会。因此,食管癌患者总的五年存活率很低。尽管多个遗传和表观遗传变化已在食管鳞癌被发现,但食管癌的确切发病机制仍有待进一步研究。因此进一步从分子水平研究食管癌的发生发展,有重要的现实意义和理论价值。长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lnc RNA)是一种长度大于200个核苷酸的非编码RNA。在人体内,lnc RNA在基因内的分布非常广泛,虽然lnc RNA并不编码蛋白质,但是其参与构成复杂且非常重要的基因表达调控网络,从而巧妙地调节基因表达。近来研究结果显示lnc RNAs在正常组织发育以及调控细胞多能性和细胞分化的过程中起重要作用。此外,lnc RNAs参与控制多种分子途径,引起基因表达改变,最终调控细胞增殖、凋亡与细胞迁移。因此lnc RNAs的表达失调与人类多种疾病密切相关,比如肿瘤形成。lnc RNA TP73-AS1定位于1p36.32,查阅国内外文献目前关于lnc RNATP73-AS1的报道非常少,仅Yu等的研究显示对比正常肺组织,lnc RNATP73-AS1在非小细胞型肺癌中表达显著下降;对比腺癌,小细胞肺癌和鳞癌,lnc RNATP73-AS1在大细胞肺癌中表达显著升高,这项结果提示lnc RNATP73-AS1在肿瘤的发展进程中可能扮演了重要角色。目前未发现lnc RNA TP73-AS1在食管癌中的相关报道。我们的研究第一次综合分析了lnc RNATP73-AS1在食管癌中表达和生物学作用,并初步探讨了其肿瘤调节作用的分子机制。本研究包括三部分:第一部分:食管鳞状细胞癌组织中lnc RNA异常表达及与临床病理特征相关性分析;第二部分:调控lnc RNATP73-AS1表达对食管鳞癌细胞系EC9706和KYSE30增殖和凋亡的影响;第三部分:lnc RNATP73-AS1作用机制的初步研究。第一部分食管鳞状细胞癌组织中lnc RNA异常表达及与临床病理特征相关性分析方法1.收集了60例食管鳞状上皮细胞癌组织标本,包括60例食管鳞状上皮细胞癌组织和60例配对的癌旁正常组织标本。2.运用lnc RNA基因芯片检测食管鳞状上皮细胞癌组织和配对的癌旁组织标本中lnc RNA的表达情况。3.运用q RT-PCR检测60例标本中4种lnc RNA(lnc RNA TP73-AS1、lnc RNA LOC345051、lnc RNA XLOC_008700和lnc RNA TMEM71)表达水平,验证lnc RNA芯片结果的可靠性。4.依据lnc RNA TP73-AS1的表达水平,运用双变量相关性分析其与食管癌病人年龄、性别、TNM分期、肿瘤分化及有无淋巴结转移之间的相关性。结果1.lnc RNA芯片检测分析得到89个差异表达的lnc RNA,其中在食管鳞癌组织中上调的lnc RNA有29个(32.6%),下调的lnc RNA有60个(67.4%)。lnc RNA TP73-AS1在食管鳞状上皮细胞癌组织中表达增高。2.q RT-PCR结果显示在4种lnc RNA中,只有lnc RNA TMEM71验证结果和基因芯片结果不一致,其余3种lnc RNA用lnc RNA检测芯片和q RT-PCR两种方法得到的结果具有很好的一致性,证实了芯片数据的可靠性。3.双变量相关性分析结果显示lnc RNA TP73-AS1的表达水平与食管癌定位及TNM分期相关(P0.05),与病人的年龄、性别、有无淋巴结转移和分化程度无相关性(P0.05)。第二部分调控lnc RNA TP73-AS1表达对食管鳞癌细胞系EC9706和KYSE30增殖和凋亡的影响方法1.制备沉默lnc RNA TP73-AS1表达的重组慢病毒,感染对数生长期EC9706和KYSE30细胞,得到下调lnc RNA TP73-AS1表达的EC9706和KYSE30细胞株。2.CCK-8试剂和克隆形成实验检测下调lnc RNA TP73-AS1对EC9706和KYSE30细胞增殖能力的影响。3.Transwell实验用来检测下调lnc RNA TP73-AS1对EC9706和KYSE30细胞侵袭转移能力的影响。4.流式细胞术和Hoechst 33342染色检测下调lnc RNA TP73-AS1对EC9706和KYSE30细胞凋亡的影响。5.裸鼠移植瘤实验从体内水平检测调控lnc RNA TP73-AS1表达对食管癌的影响。结果1.对比空白对照组,转染lnc RNA TP73-AS1 si RNA1组和lnc RNA TP73-AS1si RNA2组的lnc RNA TP73-AS1表达水平显著下调(P0.01),得到下调lnc RNA TP73-AS1表达的EC9706和KYSE30细胞株。2.CCK8实验结果显示:与对照组比较,lnc RNA TP73-AS1 si RNA1组和lnc RNA TP73-AS1 si RNA2组EC9706和KYSE30细胞的生长在转染24h后出现显著抑制(P0.05),并且随时间的延长而日益显著。3.EC9706细胞克隆形成实验结果显示空白对照组,无关序列对照组,lnc RNA TP73-AS1 si RNA1组和lnc RNA TP73-AS1 si RNA2组克隆形成数分别为162.0±19.3;167.4±18.3;47.3±7.8和56.3±7.8。KYSE30细胞克隆形成实验结果显示空白对照组,无关序列对照组,lnc RNA TP73-AS1 si RNA1组和lnc RNA TP73-AS1 si RNA2组克隆形成数分别为155.0±17.2;159.2±18.6;43.5±7.5和49.5±7.5。说明下调食管癌细胞中lnc RNA TP73-AS1表达,EC9706和KYSE30细胞克隆数显著减少(P0.05),其生长受到显著抑制。4.Annexin V/Pl染色结果提示:lnc RNA TP73-AS1 si RNA1组和lnc RNA TP73-AS1 si RNA2组EC9706和KYSE30细胞凋亡率与si RNA无关序列和空白对照组对照组相比显著升高,差异均有统计学意义(P0.05)。5.EC9706细胞Hoechst 33342染色实验结果显示空白对照组、si RNA无关序列对照组细胞的凋亡率分别为(5.21±0.61)%和(5.42±0.72)%;lnc RNA TP73-AS1si RNA1组和lnc RNA TP73-AS1 si RNA2组细胞凋亡率为(20.72±3.28)%和(18.70±3.10)%,与空白对照组、si RNA无关序列对照组细胞的凋亡数比较显著升高,差异均有显著性(P0.05)。KYSE30细胞实验结果显示空白对照组、si RNA无关序列对照组细胞的凋亡率分别为(6.12±0.75)%和(5.80±0.65)%;lnc RNA TP73-AS1 si RNA1组和lnc RNA TP73-AS1 si RNA2组细胞凋亡率为(23.36±4.23)%和(24.20±4.30)%,相比空白对照组和si RNA无关序列对照组,细胞的凋亡数显著升高,差异有显著性(P0.05)。6.Transwell侵袭实验结果显示lnc RNA TP73-AS1 si RNA1组和lnc RNA TP73-AS1 si RNA2组细胞侵袭数与空白对照组和si RNA无关序列对照组相比差异无显著性(P0.05)。7.裸鼠移植瘤体内实验结果显示对比空白对照组和si RNA无关序列对照组,lnc RNA TP73-AS1 si RNA组移植瘤显著减小,荧光信号值也显著降低(P0.05)。第三部分lnc RNA TP73-AS1作用机制的初步研究方法1.采用m RNA芯片检测下调lnc RNA TP73-AS1表达和无关序列对照si RNA的EC9706和KYSE30细胞的m RNA表达谱。2.分析芯片结果,使用q RT PCR和Western-blot检测下调lnc RNA TP73-AS1表达EC9706和KYSE30细胞中的BDH2的表达水平。3.制备沉默BDH2表达的EC9706和KYSE30细胞。CCK-8试剂盒、Hoechst33342染色和Western Blot检测下调BDH2对食管癌细胞增殖和凋亡的影响。4.q RT-PCR检测60例食管癌标本和对应癌旁组织中BDH2 m RNA表达情况并与临床病理特征和lnc RNA TP73-AS1进行相关性分析。5.构建lnc RNA TP73-AS1野生型和突变型载体,q RT PCR检测野生型和突变型lnc RNA TP73-AS1对EC9706和KYSE30细胞株中mi R-141-3p表达的影响。6.双荧光素酶报告实验验证BDH2是mi R-141-3p的靶基因。7.克隆形成实验和流式细胞仪检测上调mi R-141-3p表达对食管癌细胞生长和凋亡的影响。结果1.m RNA芯片分析结果显示:对比转染无关序列si RNA对照组的EC9706和KYSE30细胞,转染lnc RNA TP73-AS1 si RNA食管癌细胞中BDH2的含量显著降低。2.q RT-PCR和Western-blot结果显示对比空白对照和无关序列对照组,下调食管鳞癌细胞EC9706和KYSE30中lnc RNA TP73-AS1的表达显著抑制了BDH2 m RNA和蛋白的表达(P0.05)。3.对比空白对照和无关序列对照组,EC9706和KYSE30细胞转染入BDH2si RNA1和BDH2 si RNA2后,BDH2表达均显著下降(P0.05)。4.CCK8结果显示,与对照组比较,BDH2 si RNA1组和BDH2 si RNA2组EC9706和KYSE30细胞在转染后24h后出现显著生长抑制(P0.05),并且随时间的延长而日益显著。5.EC9706细胞Hoechst 33342染色实验结果显示空白对照组、si RNA无关序列对照组细胞的凋亡率分别为(4.22±0.45)%和(4.31±0.47)%;BDH2 si RNA1组和BDH2 si RNA2组细胞凋亡率为(17.70±1.80)%和(16.11±1.75)%,与si RNA无关序列对照组、空白对照组细胞的凋亡数相比显著升高,差异具有统计学意义(P0.05)。KYSE30细胞实验结果显示空白对照组、si RNA无关序列对照组细胞的凋亡率分别为(5.23±0.45)%和(5.40±0.52)%;BDH2si RNA1组和BDH2 si RNA2组细胞凋亡率为(19.71±2.10)%和(17.20±1.80)%,相比空白对照组和si RNA无关序列对照组,细胞的凋亡数显著升高,差异具有显著性(P0.05)。6.对比空白对照组,转染BDH2 si RNA1或lnc RNATP73-AS1 si RNA1后,EC9706和KYSE30细胞中BDH2表达显著下降;cleaved caspase-3和cleaved caspase-9表达显著升高;但是Bcl-2,Bax和pro-caspase-9的表达在三个实验组之间无显著差异。7.对比癌旁正常组织,食管癌组织中BDH2表达显著升高(P0.05),经统计学分析显示食管癌组织中BDH2的表达水平与食管癌TNM分期密切相关,与病人的年龄、性别、有无淋巴结转移、分化程度和肿瘤部位无相关性(P0.05)。食管癌组织中lnc RNA TP73-AS1表达与BDH2 m RNA表达存在显著正相关性(R2=0.619)8.生物信息学分析lnc RNA TP73-AS1和mi R-141-3p存在2个相互作用的seed region区特异结合位点,分别位于chr1:3655109-3655129[-]和chr1:3662504-3662525[-]。9.lnc RNA TP73-AS1通过与2个seed region区特异结合对EC9706和KYSE30细胞株中mi R-141-3p表达起负调控作用。10.BDH2是mi R-141-3p的靶基因。转染mi R-141-3p mimics能抑制食管癌细胞生长,诱导其细胞凋亡,提示lnc RNA TP73-AS1通过作用于mi R-141-3p增加BDH2表达,从而抑制食管癌细胞生长,促进其凋亡。结论1.本研究筛选得到89个差异表达的lnc RNA基因,其中有29个(32.6%)上调,60个(67.4%)下调。lnc RNA TP73-AS1和BDH2在食管鳞癌组织中异常高表达,二者表达存在正相关,且与TNM分期相关。2.下调食管鳞癌EC9706和KYSE30细胞中lnc RNA TP73-AS1表达可有效抑制食管鳞癌EC9706和KYSE30细胞的增殖并且促进细胞凋亡。3.lnc RNA TP73-AS1通过与2个seed region区特异结合负调控mi R-141-3p表达;BDH2是mi R-141-3p的靶基因,mi R-141-3p通过与BDH2 3’UTR结合负调控其表达。食管鳞癌中lnc RNA TP73-AS1对增殖和凋亡作用的机制可能部分是由于lnc RNA TP73-AS1通过调控mi R-141-3p表达,进而影响BDH2基因表达,发挥其生物学作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.1
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本文编号：2229181