【摘要】：肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是世界第五大常见恶性肿瘤,且位居肿瘤相关性死亡的第三位。以手术切除为主的综合治疗手段广泛应用于临床,然而,预后较差仍是亟待解决的问题,主要原因是术后肿瘤易复发转移,具体导致肿瘤复发及转移的机制目前尚不明确。肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSCs)是指肿瘤组织中存在的少数具备高度增殖、自我更新能力及多向分化潜能的细胞,在启动肿瘤形成和生长中起着决定性作用。随着对CSCs研究的不断深入及从肝癌组织和细胞系中分离出肝癌干细胞,肝癌中存在肝癌干细胞的观点正被广大学者接受,这种细胞成瘤能力强,是肿瘤复发和转移的罪魁祸首。杀灭肿瘤干细胞或抑制其增殖可能是减少术后复发的关键,但这类细胞对放疗和化疗均不敏感,针对这类细胞目前缺少有效的治疗方法。环氧化酶(cyclooxygenase-2, COX-2)是一个非常重要的肿瘤相关基因,已证实COX-2在多种肿瘤组织中呈现高表达,它能够抑制细胞凋亡,促进肿瘤细胞增殖、侵袭及转移,以及促进肿瘤血管生成,增强肿瘤细胞耐药性,与肿瘤发生发展密切相关。最新研究表明COX-2亦在调控CSCs增殖、自我更新、侵袭力及放疗敏感性等方面发挥重要作用。因此,以COX-2作为CSCs研究的一个切入点,有望为临床根治肿瘤和预防复发、转移提供新思路。研究发现COX-2抑制剂可明显降低罹患结肠癌、肺癌、乳腺癌及卵巢癌的风险,因而使用COX-2抑制剂预防肿瘤生长和复发有极大的潜在价值。目前,尚无相关研究证实COX-2参与调控肝癌干细胞,亦无相关研究报道COX-2抑制剂能够抑制肝癌干细胞特性,因此值得深入研究。一旦上述两个疑问被解开,将为应用COX-2抑制剂预防肝癌生长、复发和转移提供实验依据。一、高转移人肝癌细胞株HCCLM3中侧群细胞分离及干细胞特性鉴定目的：应用紫外光激发的流式细胞荧光活化分选法(fluorescence-activated cell sorting, MACS)分选高转移潜能人肝癌细胞株HCCLM3中的侧群细胞(side population, SP),并探讨其生物学特性。方法：常规培养不同转移潜能肝癌细胞株HCCLM3、MHCC97-H、 MHCC97-L及Huh7,取对数生长期细胞消化、计数后制备单细胞悬液,分别予以不同终浓度荧光染料Hoechst33342染色,以维拉帕米拮抗组为对照。流式细胞仪检测Hoechst33342荧光,紫外光激发产生两种散射光信号,以Hoechst Blue为Y轴,Hoechst Red为X轴作二维散点图,将低Hoechst Blue及低Hoechst Red且对照组缺失的区域定义为SP细胞的“门”,多数细胞集中区域为主群(main population, MP)细胞。从肝癌细胞株HCCLM3中分选SP细胞和MP细胞,于荧光显微镜观察SP细胞及MP细胞内Hoechst33342染料荧光强度差异。应用体外培养实验观察SP及MP细胞的自我更新能力,CCK8细胞增殖及平板克隆形成实验观察SP及MP细胞的增殖及克隆形成能力,CCK8法观察化疗药物对SP及MP细胞生长的抑制作用,Transwell实验观察SP及MP细胞的迁移和侵袭能力,应用裸鼠皮下成瘤实验观察SP及MP细胞的致瘤能力；应用实时荧光定量PCR检测SP及MP细胞中干细胞相关基因Nanog、Oct4、Sox2、Klf4、Sall4表达情况,流式细胞仪检测SP及MP细胞中干细胞表面标记物ABCG2、CD133、CD90、EpCAM、CD13、CD44表达情况。结果：人肝癌细胞株HCCLM3、MHCC97-H、MHCC97-L及Huh7中均存在SP细胞,比例分别为(16.9+1.8)%、(8.4+0.7)%、(4.6+0.5)%、(1.0+0.2)%,差异有统计学意义(P0.05)；为满足后续实验要求,选择高转移人肝癌细胞株HCCLM3进行分选。荧光显微镜下观察SP细胞中Hoechst33342的荧光强度明显弱于MP细胞。体外培养时SP细胞可产生SP及MP细胞,而MP细胞不能产生SP细胞；SP细胞增殖能力明显强于MP细胞(P0.05)；SP细胞形成的克隆球体积更大,结构更紧密,克隆形成率高达(35.6+4.4)%,明显高于MP细胞(10.2±3.1)%(P0.05)；SP细胞具备较强的抵抗化疗药物作用(P0.05)；Transwell实验提示SP细胞的迁移和侵袭能力均明显高于MP细胞(均P0.05)；裸鼠皮下成瘤实验中5×103个SP细胞即可在4w观察期内形成皮下移植瘤,而MP细胞则需要5×105个才能形成皮下移植瘤。PCR结果示SP细胞中Nanog、Sox2、 Klf4、Sall4和Oct4 mRNA平均表达水平分别是MP细胞的3.78、2.37、2.92、1.83、1.46倍；流式细胞仪检测结果示SP细胞中干细胞表面标记物ABCG2、CD90及CD13的阳性表达率明显高于MP细胞(均P0.05),SP和MP细胞几乎全部表达CD44,但不表达CD133和EpCAM。结论：不同转移潜能肝癌细胞株HCCLM3、MHCC97-H、MHCC97-L及Huh7中存在不同比例的SP细胞,可能与肝癌的转移潜能有关；应用MACS可稳定分选HCCLM3中的SP细胞及MP细胞。HCCLM3细胞中SP细胞富集了肝癌干细胞,可能与其较高的转移潜能有关。二、慢病毒介导COX-2过表达对肝癌干细胞生物学特性的影响目的：探讨环氧化酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)在SP细胞及MP细胞中的表达情况；构建重组慢病毒COX-2基因过表达载体并感染高转移人肝癌细胞株HCCLM3,探讨COX-2过表达对SP细胞干细胞特性的影响及分子机制。方法：从肝癌细胞株HCCLM3中分选SP细胞和MP细胞。采用实时荧光定量PCR及Western blotting法检测SP细胞及MP细胞中COX-2 mRNA及蛋白表达。另外,取对数生长期人肝癌细胞HCCLM3接种于培养板中,分为3组：感染COX-2基因重组慢病毒过表达载体为转染组(LV-COX-2组)；感染慢病毒空载体为阴性对照组(LV-NC组)；空白对照组不做任何处理。流式细胞仪分选三组细胞中SP细胞。采用CCK8细胞增殖及平板克隆形成实验观察SP细胞的增殖及克隆形成能力,裸鼠皮下成瘤实验观察SP细胞的致瘤能力。采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)测定SP细胞培养上清中PGE2含量,实时荧光定量PCR及western blotting技术检测SP细胞中COX-2 PTEN及PDCD4 mRNA及蛋白表达情况。结果：PCR结果示SP细胞中COX-2 mRNA平均表达水平是MP细胞的17.45倍(P0.05)；Western blotting结果示SP细胞中COX-2蛋白平均表达水平是MP细胞的9.23倍(P0.05)。LV-COX-2/HCCLM3中SP细胞含量为(19.9+1.4)%,明显多于LV-NC/HCCML3(17.3±0.6)%及HCCLM3(16.9+1.8)%,差异有统计学意义(P0.05)。LV-COX-2/SP细胞增殖及克隆形成能力均明显强于LV-NC/SP细胞和SP细胞(均P0.05)；LV-COX-2/SP细胞形成裸鼠皮下移植瘤平均体积明显大于LV-NC细胞和SP细胞(均P0.05)。 PCR及western blotting结果示LV-COX-2/SP细胞中COX-2 mRNA及蛋白表达较LV-NC/SP细胞和SP细胞明显上调,而PTEN及PDCD4 mRNA及蛋白表达明显下调。LV-COX-2/SP细胞培养上清中PGE2含量较LV-NC/SP细胞及SP细胞明显增加(均P0.05)。结论：COX-2过表达能够促进SP细胞干细胞特性,提示COX-2可能通过下调PTEN及PDCD4激活肝癌干细胞。三、COX-2选择性抑制剂塞来昔布对肝癌干细胞的抑制作用目的：探讨选择性COX-2抑制剂塞来昔布对SP细胞干细胞特性的影响。方法：从肝癌细胞株HCCLM3中分离SP细胞,采用CCK8法观察塞来昔布对其增殖能力的影响,平板克隆形成实验观察塞来昔布对其克隆能力的影响,Annexin V/7-AAD双染色法检测塞来昔布诱导其凋亡的情况。裸鼠皮下接种SP细胞后随机分为2组,实验组给予塞来昔布灌胃,对照组给予生理盐水灌胃,观察裸鼠皮下移植瘤形成情况。采用ELISA法测定SP细胞培养上清中PGE2含量,实时荧光定量PCR及western blotting检测SP细胞中COX-2、PTEN及PDCD4 mRNA及蛋白表达情况。结果：塞来昔布对SP细胞增殖有显著抑制作用,呈时间和剂量依赖性；塞来昔布明显降低SP细胞的克隆形成能力(P0.05)；也能够诱导SP细胞凋亡,呈剂量依赖性。实验组及对照组裸鼠皮下均形成皮下移植瘤,但前者移植瘤平均体积明显小于后者(P0.05)。经塞来昔布处理后,SP细胞中COX-2表达下调,而PTEN及PDCD4明显上调：随着药物浓度的增加,SP细胞培养上清中PGE2含量逐渐降低。结论：塞来昔布能够抑制SP细胞增殖及克隆能力,诱导SP细胞凋亡,并对裸鼠皮下移植瘤有明显抑制作用,说明塞来昔布可能通过上调PTEN及PDCD4抑制肝癌干细胞特性。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7
【相似文献】
相关期刊论文 前10条
1 宋凯;杨硕菲;吴俊华;江春平;;肝癌干细胞的研究进展[J];世界华人消化杂志;2009年36期
2 严威;吴国洋;;肝癌干细胞分离鉴定研究进展[J];肝胆外科杂志;2010年03期
3 李广权;陈伟强;;肝癌干细胞的研究现状[J];医学综述;2013年03期
4 张朵;朱海英;马凤云;胡以平;;肝癌干细胞的研究现状[J];生命的化学;2006年01期
5 陈丽;戴广海;;肝癌干细胞研究现状[J];临床肿瘤学杂志;2008年12期
6 唐飞;吕洪敏;向慧玲;;肝癌干细胞的研究现状[J];实用肝脏病杂志;2008年02期
7 张伟;陈孝平;;肝癌干细胞的研究进展[J];临床外科杂志;2008年09期
8 张华;高志红;许田英;朱建凤;文家斌;张阳;;常规化疗对肝癌干细胞的作用[J];胃肠病学和肝病学杂志;2009年06期
9 徐文;曹璐;殷正丰;;肝癌干细胞研究进展与方向[J];癌症;2009年09期
10 孙力超;赵璇;遇珑;韩璐璐;刘彤;胡海;孙立新;杨治华;冉宇靓;;抗肝癌干细胞功能性单克隆抗体的研制[J];中国肿瘤生物治疗杂志;2010年02期
相关会议论文 前4条
1 单娟娟;钱程;;悬浮条件培养法富集肝癌干细胞[A];中华医学会病理学分会2010年学术年会日程及论文汇编[C];2010年
2 尹川;谢渭芬;;肝癌干细胞及其分化治疗[A];第九次全国消化系统疾病学术会议专题报告论文集[C];2009年
3 殷胜勇;陈新华;胡晨;;CD133阳性肝癌干细胞在肝癌肝移植术后肿瘤复发中的作用及纳秒脉冲进行干预的初步实验研究[A];2013中国器官移植大会论文汇编[C];2013年
4 杜智;宋文芹;张世光;高英堂;朱争艳;王毅军;只丹琮;;人原发性肝癌细胞建系及其生物学特性的初步鉴定[A];天津市生物医学工程学会2007年学术年会论文摘要集[C];2007年
相关重要报纸文章 前1条
1 本报记者 王雪敏;肝癌干细胞及其分化治疗[N];医药经济报;2010年
相关博士学位论文 前10条
1 张华;肝癌干细胞的鉴定及化疗对肝癌干细胞作用的研究[D];大连医科大学;2009年
2 黎江;肝癌干细胞新型培养体系的建立以及治疗靶点筛选[D];第二军医大学;2012年
3 郭哲;环氧化酶-2对肝癌干细胞生物学特性的影响及机制研究[D];广西医科大学;2015年
4 刘卫辉;大鼠肝干细胞和肝癌干细胞间生物学特性差异分析及相关分子调控机制研究[D];第四军医大学;2012年
5 朱政;肝癌干细胞表面标志物的鉴定与特性研究[D];复旦大学;2009年
6 孙岚;ACNP-MET纳米药物递送系统及其对肝癌干细胞靶向性研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2013年
7 刘丽梅;去乙酰化酶SIRT1在肝癌干细胞自我更新中的作用及其机制研究[D];第三军医大学;2013年
8 沈俊杰;Nanog阳性肝癌细胞在肝癌干细胞层级分化中的地位与作用研究[D];第三军医大学;2014年
9 张俊;microRNA-150调控肝癌干细胞恶性表型分子机制的研究[D];重庆医科大学;2012年
10 冯冬峰;CD133~+CD24~+肝癌干细胞的分离、鉴定及生物学特征的研究[D];吉林大学;2014年
相关硕士学位论文 前10条
1 曹璐;球培养法富集肝癌干细胞样亚群及其特征鉴定[D];第二军医大学;2010年
2 杨军;肝癌干细胞特异性标志物的实验研究及其临床病理联系[D];中南大学;2009年
3 常文娟;低剂量顺铂富集肝癌干细胞的实验研究[D];大连医科大学;2011年
4 容雁;抗人肝癌干细胞功能性单抗的研究[D];广西医科大学;2012年
5 陶璐;基于肿瘤耐药特性构建肝癌干细胞富集模式的实验研究[D];广西医科大学;2012年
6 王云霞;人肝癌干细胞单抗抑制肝癌的生长和转移[D];北京协和医学院;2012年
7 曲平波;靶向肝癌干细胞的细胞毒性T淋巴细胞的研究[D];第二军医大学;2013年
8 闫伟伟;肝癌干细胞表面标志物的初步筛查及其临床应用研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2010年
9 赵璇;抗人肝癌干细胞功能性抗体及靶抗原的研究[D];中国协和医科大学;2010年
10 刘志强;原发性肝癌组织中肝癌干细胞的检测及临床意义[D];山东大学;2010年
，
本文编号：
2245647
