【摘要】：背景缺氧微环境和上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)与肿瘤的浸润、转移、凋亡抵抗和耐药有着密切的关系。EMT是缺氧诱发食管鳞癌生长和转移的重要机制。信号转导与转录激活因子3(signal transducer and activator of Transcription,STAT3)是肿瘤发生发展的重要转录因子,磷酸化活化的STAT3,与缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)协同作用,调控细胞缺氧效应,参与肿瘤恶性转化、转移等进程。STAT3是否参与食管鳞癌缺氧诱导的EMT调控?其中有着怎样的临床意义?目前尚未见报道。本研究将着力解决这些问题。第一部分食管鳞癌组织pSTAT3、HIF-1α表达与EMT的关系及临床意义目的:研究磷酸化STAT3(pSTAT3)、HIF-1α和E-cadherin三者的关系,及其对食管鳞癌临床特征和预后的影响。方法:收集食管鳞癌根治切除标本106例,免疫组化检测目标蛋白的表达,记录患者复发及生存时间。比较食管正常上皮与食管鳞癌pSTAT3、HIF-1α和E-cadherin的表达,分析食管鳞癌组织三者表达与临床病理特征的关系,kaplan-meier法分析生存数据,log-rank检验和cox回归方法分析影响生存的因素。结果:1.pstat3的表达食管鳞癌[71.7%(76/106)]较正常食管上皮[57.4%(58/101)]增加,hif-1α的表达食管鳞癌[73.6%(78/106)]较正常食管上皮[60.4%(61/101)]增加,e-cadherin的表达食管鳞癌[40.6%(43/106)]较正常食管上皮[100%(101/101)]下降,差异均有统计学意义(p0.05);2.食管鳞癌组织pstat3与hif-1ɑ表达正相关(γ=0.21),pstat3与e-cadherin负相关(γ=-0.20),hif-1ɑ与e-cadherin负相关(γ=-0.18),差异均有统计学意义(p0.05);3.平均随访40.12个月,平均无病生存(dfs)36.71(95%ci32.78~40.64)个月,平均总生存(os)40.12(95%ci36.85~43.40)个月,多因素分析提示分期增加、pstat3阳性表达与不良dfs和os有关,差异均有统计学意义(p0.05)。第二部分缺氧对食管鳞癌细胞emt影响的研究目的:探明食管鳞癌中缺氧与emt的关系,缺氧对stat3表达的影响。方法:食管鳞癌细胞株te-1及ec-1,cocl2模拟缺氧环境,观察细胞形态变化、划痕实验和transwell小室检测细胞运动和侵袭的变化,realtimepcr检测hif-1ɑ、e-cadherin、vimentin和stat3mrna,westernblot和免疫荧光检测hif-1α、e-cadherin、vimentin、pstat3蛋白含量的变化。结果:1.缺氧状态te-1及ec-1形态发生间质样改变;2.ec-1细胞缺氧及常氧12h迁移率分别为(35.14±1.45)%和(13.12±3.25)%,te-1细胞分别为(30.65±1.91)%和(14.51±2.17)%;ec-1细胞缺氧及常氧12h侵袭率分别为(318.26±40.83)%和100%,te-1细胞分别为(300.56±16.83)%和100%:缺氧条件下的细胞迁移率和侵袭率与常氧条件相比,差异均有统计学意义(p0.05);3.e-cadherinmrna缺氧较常氧降低[缺氧和常氧24h相对mrnaec-1细胞分别为0.02(范围0.01~0.03)和1,te-1细胞分别为0.02(范围0.01~0.02)和1],差异有统计学意义(p0.05);vimentinmrna缺氧较常氧增高[缺氧和常氧24h相对mrnaec-1细胞分别为37.07(范围35.13~39.12)和1,te-1细胞分别为7.34(范围5.42~9.94)和1],差异有统计学意义(p0.05);stat3mrna缺氧较常氧增高[缺氧和常氧24h相对mrnaec-1细胞分别为31.48(范围25.90~38.26)和1,te-1细胞分别为17.60(范围14.68~21.12)和1],差异有统计学意义(p0.05);hif-1αmrna变化不一[缺氧和常氧24h相对mrnaec-1细胞分别为1.38(范围1.36~1.41)和1(p=0.01),te-1细胞分别为0.79(范围0.76~0.82)和1(p=0.14)];4.缺氧较常氧e-cadherin蛋白表达下降[缺氧和常氧24h相对蛋白量ec-1细胞分别为(0.77±0.07)和1,te-1细胞分别为(0.55±0.05)和1],差异有统计学意义(p0.05);缺氧较常氧vimentin蛋白表达升高[缺氧和常氧24h相对蛋白量ec-1细胞分别为(1.74±0.08)和1,te-1细胞分别为(1.86±0.35)和1],差异有统计学意义(p0.05);缺氧较常氧hif-1α蛋白表达升高[缺氧和常氧24h相对蛋白量ec-1细胞分别为(2.67±0.37)和1,te-1细胞分别为(2.79±0.25)和1],差异有统计学意义(p0.05);缺氧较常氧pstat3蛋白表达升高[缺氧和常氧24h相对蛋白量ec-1细胞分别为(2.45±0.29)和1,te-1细胞分别为(1.38±0.22)和1],差异有统计学意义(p0.05)。第三部分干扰stat3对缺氧诱导的食管鳞癌emt的影响及机制目的:研究stat3对于缺氧诱导的食管鳞癌emt的调节作用及具体机制。方法:构建stat3sirna质粒,转染ec-1细胞,观察缺氧条件细胞形态变化,检测细胞迁移和侵袭变化,hif-1α、e-cadherin、vimentin蛋白和mrna、stat3mrna和pstat3蛋白的变化,chip方法检测缺氧条件stat3与hif-1α启动子的结合。结果1.westernblot验证stat3sirna有效抑制stat3的表达;2.对照、空载体、stat3sirna组常氧条件下迁移率分别(17.94±0.62)%、(16.28±0.21)%、(9.90±0.97)%,缺氧条件下迁移率分别是(33.82±1.42)%、(35.90±1.51)%、(10.77±1.56)%,对照、空载体、stat3sirna组常氧条件下侵袭率分别为(100.00±0.00)%、(89.65±6.91)%、(33.60±4.17)%,缺氧条件下侵袭率分别为(276.08±19.88)%、(268.71±21.59)%、(109.95±11.96)%:stat3sirna明显的抑制了常氧和缺氧条件下食管癌细胞的迁移和侵袭力,差异有统计学意义(p0.05);3.常氧条件vimentin相对mrna在stat3sirna组和空白对照组分别为0.05(范围0.04~0.06)和1,hif-1α相对mrna在stat3sirna组和空白对照组分别为0.11(范围0.09~0.13)和1,e-cadherin相对mrna在stat3sirna组和空白对照组分别为4.43(范围4.18~4.70)和1;缺氧条件vimentin相对mrna在stat3sirna组和空白对照组分别为0.31(范围0.23~0.42)和32.25(范围30.48~34.13),hif-1α相对mrna在stat3sirna组和空白对照组分别为0.14(范围0.12~0.15)和1.22(范围1.15~1.29),e-cadherin相对mrna在stat3sirna组和空白对照组分别为4.06(范围3.56~4.63)和0.06(范围0.05~0.07):常氧和缺氧条件,stat3sirna明显抑制vimentin、hif-1αmrna的表达,增高e-cadherinmrna的表达,差异有统计学意义(p0.05);4.常氧条件pstat3相对蛋白含量在stat3sirna组和空白对照组分别为0.49±0.06和1,hif-1α分别为0.68±0.06和1,vimentin分别为0.78±0.07和1,e-cadherin分别为3.21±0.16和1;缺氧条件pstat3相对蛋白含量在stat3sirna组和空白对照组分别为0.97±0.09和1.46±0.11;hif-1α分别为1.01±0.07和1.32±0.06;vimentin分别为0.84±0.10和1.76±.015,e-cadherin分别为3.40±0.37和0.81±0.03:常氧和缺氧条件,stat3sirna明显抑制pstat3、hif-1α、vimentin蛋白的表达,增高e-cadherin蛋白的表达,差异有统计学意义(p0.05);5.chip提示stat3与hif-1α启动子的结合。第四部分体内抑制stat3对食管鳞癌移植瘤hif-1α表达及emt的影响目的:研究食管鳞癌肿瘤体内缺氧的改变及emt变化,stat3sirna在体内对缺氧诱导的食管鳞癌emt的影响。方法:建立ec-1食管鳞癌裸鼠移植瘤模型,尾静脉注射的方法分别给予stat3sirna及对照治疗,观察肿瘤的生长状况,检测不同组别移植瘤stat3、pstat3、hif-1α和e-cadherin的表达结果:1.生理盐水对照组、空白载体对照组和stat3sirna治疗组移植瘤的平均大小分别为(2.97±0.21)×103mm3、(2.80±0.39)×103mm3、(2.21±0.40)×103mm3,stat3sirna治疗组较生理盐水对照组和空白载体对照组肿瘤明显缩小,差异有统计学意义(p0.05);2.stat3sirna治疗组肿瘤组织表达stat3、pstat3、hif-1α、vimentin下降,表达e-cadherin增加。结论1.食管鳞癌pstat3、hif-1α表达较正常食管上皮升高,e-cadherin表达较正常食管上皮下降,三者表达具有相关性,pstat3阳性预示食管鳞癌预后不良。2.缺氧促使stat3表达上调,食管鳞癌细胞发生emt,细胞迁移和侵袭性增强。3.stat3经由hif-1α调控缺氧诱导的食管鳞癌emt:抑制stat3可下调hif-1α表达,逆转缺氧诱导的食管鳞癌细胞emt;stat3与hif-1α启动子结合,从基因水平调控hif-1α的表达。4.食管鳞癌裸鼠移植瘤中存在hif-1α表达升高及emt现象;体内干扰stat3的表达可以抑制食管鳞癌组织hif-1α的表达及emt现象,并抑制肿瘤的生长。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.1
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本文编号：
2252838
