基于RNA-seq技术的宫颈鳞癌转录组学研究

发布时间：2018-10-05 10:19

【摘要】：第一部分基于RNA-seq技术的宫颈鳞癌和癌旁组织的差异表达基因分析目的：宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一,居女性癌症患者死亡原因的第4位。除HPV感染外,被感染细胞的基因组异常才能最终导致宫颈癌的发生发展,因此与细胞生长分化相关的基因表达调控异常在宫颈癌的发病机制中同样具有重要作用。转录组是基因功能及结构研究的基础和出发点。本研究拟应用RNA-seq技术全面分析宫颈鳞癌组织和癌旁组织的转录组,筛选出差异表达基因,进而分析差异表达基因的相互作用、涉及的信号通路、以及差异表达基因与宫颈鳞癌临床病理因素的相关性,寻找可能的宫颈鳞癌诊断的分子标记物和靶向治疗目标,为宫颈癌的诊治提供实验依据和理论基础。方法：构建cDNA文库后,应用RNA-seq全面分析3对宫颈鳞癌和对应癌旁组织的转录组,筛选出宫颈鳞癌组织和癌旁组织的差异表达基因。应用GO(Gene Ontology)方法分析差异表达基因的功能聚类,应用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信号通路富集性方法分析差异表达基因相关的信号通路。构建蛋白质相互作用网络,分析差异表达基因之间的相互作用,筛选出重要的差异表达基因。应用实时荧光定量PCR和免疫组化的方法验证宫颈鳞癌组织和癌旁组织的差异基因的表达水平,并分析差异基因与宫颈鳞癌临床病理因素的相关性。结果：3对宫颈鳞癌组织和癌旁组织共有347个差异表达基因,包括104个表达一致上调的基因、148个表达一致下调的基因。347个差异表达基因被分为73个功能聚类,104个表达一致上调的差异表达基因被分为34个功能聚类,148个表达一致下调的差异表达基因被分为80个功能聚类。通过KEGG信号通路富集性分析,我们发现差异表达基因富集到6条信号通路上,包括细胞因子-细胞因子受体相互作用信号通路、补体系统及凝血相关信号通路、视黄醇代谢相关信号通路、趋化因子相关信号通路、细胞色素p450外源性物质代谢相关信号通路、黑素原生成相关信号通路。蛋白质相互作用网络分析发现三个重要的差异表达基因,为RDH12,UBD, SAA1。与癌旁组织相比,RDH12基因在74.5%的宫颈鳞癌组织中表达下降,与肿瘤直径及宫颈肌层浸润深度负相关。UBD基因在61.7%的宫颈鳞癌组织中表达升高,与肿瘤直径及淋巴结转移正相关。SAA1基因在57.4%的宫颈鳞癌组织中表达升高,与肿瘤直径、淋巴结转移、宫颈肌层浸润深度正相关。结论：本研究首次利用RNA-seq技术对宫颈鳞癌和癌旁组织中的差异表达基因进行了全面分析,发现宫颈鳞癌与癌旁组织中共有347个差异表达基因,富集到6个信号通路上,其中差异表达基因RDH12, UBD, SAA1与宫颈鳞癌临床病理因素相关,可能成为宫颈癌诊断和治疗的靶基因,但其在宫颈鳞癌发生发展中的机制仍需进一步研究。第二部分基于RNA-seq技术的宫颈鳞癌与癌旁组织的可变剪接分析目的：前体mRNA的可变剪接是真核生物蛋白质多样性的重要调控机制。mRNA异常剪接与肿瘤发生关系密切,涉及细胞周期、代谢、及信号转导调控。可变剪接在宫颈鳞癌中的作用机制尚不清楚。本研究拟应用RNA-seq技术全面分析宫颈鳞癌组织和癌旁组织中的可变剪接事件、可变剪接基因、可变剪接涉及的信号通路、可变剪接基因与宫颈鳞癌临床病理因素的相关性,为宫颈癌的诊治提供新的思路。方法：用RNA-seq技术分析4对宫颈鳞癌和癌旁组织的转录本信息,用SpliceMap软件检测宫颈鳞癌组织和癌旁组织的可变剪接事件,使用Bowt ie软件将每个检测片段与人类基因组进行比对,筛选出宫颈鳞癌特异性的可变剪接事件。应用KEGG信号通路显著性富集方法分析可变剪接事件参与的信号转导通路。根据4个宫颈鳞癌组织中的可变剪接事件mapped reads的数目,挑选出KLHDC7B和SYCP2基因,并用RT-PCR方法验证可变剪接基因KLHDC7B和口SYCP2在宫颈鳞癌组织中的表达水平,并分析可变剪接基因与宫颈鳞癌临床病理因素的相关性。结果：根据RNA-seq数据,4个宫颈鳞癌组织中共有35个特异性的可变剪接基因。KEGG信号通路富集性分析表明宫颈鳞癌特异性的可变剪接事件富集到16条信号通路上,包括代谢相关信号通路、细胞内吞作用相关信号通路、ras信号通路等。KLHDC7B基因存在可变5’剪接位点,该基因在66.0%的宫颈鳞癌组织中表达升高,与肿瘤直径正相关。SYCP2基因存在外显子跳跃,该基因在38.2%的宫颈鳞癌组织中表达升高,与宫颈肌层浸润深度正相关。结论：本研究首次利用RNA-seq技术对宫颈鳞癌和癌旁组织转录本中的可变剪接事件进行了全面分析,发现宫颈鳞癌中的可变剪接事件富集到16条信号通路上,筛选出宫颈鳞癌特异性的可变剪接基因共35个,其中可变剪接基因KLHDC7B和SYCP2与宫颈鳞癌临床病理因素相关,可能成为宫颈癌诊断的分子标记物和治疗的靶点,但其在宫颈癌发生发展中的作用机制仍需进一步研究。
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【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.33

【参考文献】