肿瘤相关成纤维细胞来源的外泌体在肝癌增殖和转移中的作用及相关机制的研究

发布时间：2018-10-05 21:01

【摘要】：【背景】肝细胞肝癌是预后较差的一类肿瘤,其致死率居所有肿瘤的第三位。肝细胞肝癌的致病因素十分复杂,主要包括病毒、真菌感染、酒精等因素导致基因突变,原癌基因激活,抑癌基因沉默。近十几年来的研究表明,肿瘤的发生发展并不仅仅是肿瘤细胞本身癌基因或是抑癌基因的改变,肿瘤周围的微环境同样作为 共犯‖参与了肿瘤的恶性转化。肿瘤的微环境中主要的细胞种类可以分为3类:血管生成细胞,浸润的免疫细胞,肿瘤相关的成纤维细胞。这三类细胞均能够与肿瘤细胞通过相互作用,参与对肿瘤细胞 肿瘤印记‖的改变过程。肿瘤相关的成纤维细胞是肿瘤微环境中一类重要的非实质细胞,高表达alpha-SMA和纤维活化蛋白FAP,分泌多种细胞因子如HGF,EGF,IGF,FGF,SDF-1等参与肿瘤细胞增殖和EMT转化过程,并能够通过分泌大量的基质成分、胶原和纤黏连蛋白等参与肿瘤微环境的重塑。外泌体是一种直径在30-150nm的囊泡结构,其中包含多种内容物,如蛋白质(细胞因子,膜受体,受体的配体等等),核酸类物质(如DNA,mRNA,miRNA,LncRNA)以及脂质,其组成成分能够影响受体靶细胞。近年来的研究表明,肿瘤相关的成纤维细胞能够通过分泌外泌体与肿瘤细胞相互交流。而肿瘤相关的成纤维细胞与正常成纤维细相比其miRNA的表达谱差异十分明显。那么肿瘤相关成纤维细胞来源的外泌体中miRNAs是否同样存在不同的表达丰度,是否参与调控了肿瘤细胞的生物学行为的改变?【实验目的】1.探讨肝癌组织中肿瘤相关成纤维细胞与癌旁组织中成纤维细胞来源外泌体中的miRNAs的差异表达情况,并筛选出候选miRNA进行功能学验证2.探讨差异表达的miR-320a对肝癌细胞恶性生物学表型的影响3.研究miR-320a参与调控肝癌细胞恶性改变的分子机制【实验方法】1.首先分离6对肝癌及癌旁组织中原代的肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)和癌旁成纤维细胞(PAFs),通过提取两种成纤维细胞分泌的外泌体,通过PCR扩增获取最终的Cdna文库,进而对其中的miRNAs进行miRNAs测序后筛选出了差异表达的miRNA。2.通过体外共培养和体内裸鼠皮下成瘤,在CAFs中过表达miR-320a,观察是否能够通过外泌体传递至肝癌细胞并发挥功能。3.利用慢病毒在肝癌细胞系中过表达miR-320a,通过CCK-8,平板克隆,Transwell及划痕实验验证,miR-320a对肝癌细胞生物学表型的影响。4.通过体内皮下成瘤实验,检测mi R-320a对肝癌细胞增殖能力的影响;通过裸鼠尾静脉,检测miR-320a对肝癌细胞肺转移能力的影响。5.利用生物信息预测软件结合荧光素酶报告基因检测验证miR-320a的靶基因。通过western blot,免疫组织化学和原位杂交试验,验证miR-320a下游分子通路。【实验结果】1.成功分离培养了肝癌组织来源的肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)及癌旁组织成纤维细胞(PAFs),并对其生物学特征及表面分子标记进行了验证。相对于PAFs,CAFs细胞表达更强的alpha-SMA和FAP,但是PDGF-beta的表达并无明显的差异。成功分离了CAFs及PAFs细胞分泌的外泌体,并对其进行了鉴定。通过构建miRNAs文库,进行测序。测序结果表明CAFs来源的外泌体中存在大量下调的促肿瘤miRNAs。共有42个下调,2个上调miRNA存在显著性差异,通过比较差异表达的miRNAs的表达量及差异倍数,最终筛选出miR-320a作为后续研究。2.通过体外间接共培养模型证实,成纤维细胞能够将cy3标记的mi R-320a通过外泌体转运至肝癌细胞,在肝癌细胞中表达红色荧光。将过表达miR-320a的成纤维细胞与肿瘤细胞共培养,qRT-PCR结果提示,MHCC97-H细胞中miR-320a的表达上调。同时体内实验证实,过表达miR-320a的成纤维细胞能够在体抑制肝癌细胞的成瘤,小动物活体成像结果提示荧光强度明显低于对照组。3.通过CCK-8、平板克隆实验证实过表达mi R-320a后能够抑制肝癌细胞的增殖能力;miR-320a能够是肝癌细胞系细胞周期阻滞于G1期。通过Transwell及划痕实验证实过表达miR-320a后能够抑制肝癌细胞侵袭和转移能力。进一步裸鼠成瘤实验,及裸鼠尾静脉肺转移模型证实了体外实验的结论。4.利用生物分析软件(TargetScan,CLIP-Seq,miRDB and miRanda)预测了miR-320a的下游靶基因PBX3。通过恢复性实验验证证实,miR-320a能够通过PBX3参与调控肝癌细胞MHCC97-H和SMM7721的增殖,侵袭和转移能力。进一步证实,PBX3可以通过影响ERK1/2磷酸化水平,参与调节了CDK2,MMP2以及EMT的相关标记物的表达。综上,我们认为肿瘤组织中CAFs分泌外泌体中的miR-320a表达下降,会引起其中的促肿瘤成分和抑肿瘤成分的平衡失调,为肝癌细胞提供了更有利于其生长转移的环境,进而介导肝癌的恶性转变。而通过在CAFs中过表达miR-320a能够有效抑制肿瘤的发展,这为肝癌的治疗提供了一个可能的方法。
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【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.7
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本文编号：2254856