【摘要】：肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是世界上发病率仅次于胃癌和食道癌的第三大常见恶性肿瘤,严重威胁人类健康。但目前临床上缺乏有效的治疗手段,尽管树突状细胞(Dendritic Cell,DC)为基础的免疫治疗在临床上表现出一定的治疗效果,但治疗效果极为有限;并且DC疫苗作为一种细胞疫苗,存在着货架期短和对病人来源细胞要求高等局限性。近年来,exosome作为细胞分泌的一种膜性生物纳米囊泡结构,受到肿瘤免疫领域的关注。特别是DC来源的exosomes(DEX)携带大量的源细胞功能蛋白,包括MHC-I/II类分子及CD80、CD86、intercellular adhesion molecule(ICAM)等免疫协同刺激因子,可以作为DC取代物,直接激活初始T细胞,诱导毒性T淋巴细胞产生,发挥抑癌效果;而且DEX在-80°C下可保存6个月,货架期较长。基于DEX独特的优势,已有报道发现,负载了肿瘤抗原短肽的DEX在体内可激活肿瘤抗原特异性CTL,发挥显著的抗肿瘤效果,但是DEX在肝细胞癌免疫治疗中治疗效果有待研究。因此,本研究旨在利用不同的肝细胞癌体外和体内模型,通过系统测试负载肝癌特异性抗原甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)的DEX_(AFP)在不同肝细胞癌小鼠模型体内的抗肿瘤效果,以确定DEX_(AFP)在肝细胞癌免疫治疗中的治疗效果和潜力,并探讨DEX_(AFP)为基础的免疫治疗潜在的作用机制。首先,我们将表达AFP蛋白的慢病毒载体转染DC2.4细胞株(以下简称DC),以获得AFP稳定表达的树突状细胞系DC_(AFP),通过流式检测确定DC_(AFP)细胞表面主要组织相容性复合体(MHC-I/MHC-II)和协同刺激因子CD80、CD86和ICAM等表达水平显著高于正常DC;并在肝细胞癌皮下瘤模型上确认了DC_(AFP)的肝癌抑制效果。对DC_(AFP)分泌的exosomes(DEX_(AFP)),进行流式检测发现,与正常DC来源的DEX相比,DEX_(AFP)富集更多的MHC-I、MHC-II、CD80、CD86和ICAM分子,表明DEX_(AFP)具有一定的免疫原性。为了测试DEX_(AFP)在体内的抗原特异性,我们将DEX_(AFP)免疫小鼠来源的脾脏细胞分别用DEX和DEX_(AFP)在体外再刺激,并将刺激后的T细胞分别与不同的肿瘤细胞(肝癌细胞Hepa1-6,H22,肺癌LLC1,胰腺癌Panc02)共孵育。结果表明:只有经DEX_(AFP)免疫过的小鼠来源脾脏T细胞可以在体外被DEX_(AFP)进一步活化,并且这些被活化的T细胞只对AFP特异性表达的小鼠肝癌细胞系Hepa1-6具有杀伤效应,显示了DEX_(AFP)的抗原特异性杀伤作用。为了进一步探究DEX_(AFP)在体内的抗肿瘤效果,我们选择了小鼠皮下瘤模型对DEX_(AFP)的治疗策略进行了优化研究。通过对皮下注射(s.c.)和尾静脉注射(i.v)两种注射方式的治疗效果和生存期比较,结果发现:尽管两者间并无显著性差异,但尾静脉注射组治疗效果稍优于皮下注射组,因此在后续试验中,我们选择尾静脉注射作为主要给药方式。进一步对不同治疗周期的优化试验中发现,多次免疫治疗效果明显优于单次,特别是每周一次,连续免疫三次治疗效果较佳,因此在后续试验中选择三次治疗(1次/周)作为主要给药周期。为确定治疗的最佳剂量,我们分别在肝细胞癌皮下瘤模型上,测试三种不同剂量,通过对不同的DEX_(AFP)治疗剂量比较后,确定单次剂量40μg/鼠为DEX_(AFP)在皮下瘤模型上的最低有效剂量。尽管肝细胞癌皮下瘤模型作为给药方式、周期和剂量优化的有效模型,但不能完全反映肝细胞癌的免疫和肿瘤微环境,而原位肝细胞癌模型则能更好地反映临床肝癌病人的免疫和肿瘤微环境。为了测试DEX_(AFP)对于原位肝细胞癌的治疗潜力和效果,我们在移植型原位肝癌模型上对DEX_(AFP)治疗效果进行了系统的测试研究。首先,我们对荷瘤7天的原位移植瘤小鼠分别进行了每周1次,连续3周和每5天用药1次,连续用药4次的给药周期比较。对其治疗效果的分析,发现两种给药方式均能显著抑制肿瘤生长,并延长荷瘤小鼠的生存期;但相较而言,连续用药3周后,DEX_(AFP)略优于连续用药4次,每5天用药1次的治疗效果。因此在后续试验中,我们选择每周1次,连续3周的给药方式,并在这一给药模式下,探讨了DEX_(AFP)的抑制肿瘤效果与免疫微环境改善之间的相关性。通过比较不同治疗时间点,DEX_(AFP)对原位肝癌荷瘤小鼠的肿瘤生长情况及相对应的免疫细胞和免疫因子水平变化;结果表明:DEX_(AFP)对小鼠原位瘤表现为持续性抑制生长作用;随着治疗次数的增加,DEX_(AFP)对免疫微环境的改善也表现为逐渐增强,特别是在2次和第3次治疗之间,治疗小鼠的免疫微环境改善最为显著,说明DEX_(AFP)对原位肝癌的治疗效果具有累计效应。为了更好地模拟临床肝癌病人病理上的异质性和复杂性及抑制性免疫微环境,同时更为全面地评价DEX_(AFP)的临床适用性。我们利用化学药物二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine,DENA)诱导法成功地建立了原发性小鼠肝癌模型。通过对原发性小鼠肝癌模型病理和免疫微环境的检测,确立了该模型的病理复杂性和异质性以及抑制性免疫微环境。在DENA诱导后7个月,在小鼠肝脏可见清晰肿瘤病灶,并检测到抑制性免疫微环境,证明原发性肝癌小鼠模型的成功建立。因此,DEX_(AFP)治疗试验从第8个月开始,进行每周一次,为期3周的治疗周期。在最后一次治疗后10周收样。通过对治疗小鼠肝脏肿瘤结节数量、重量和大小及体积的测量,结果发现:与PBS和DEX组相比,DEX_(AFP)能够明显减少小鼠肿瘤结节数量、体积以及肝脏的代偿性增生,表现出显著的地抑瘤效果。为了阐明DEX_(AFP)对原发性HCC免疫和肿瘤微环境的影响,我们分别检测小鼠免疫微环境和肿瘤微环境相应指标,结果发现:DEX_(AFP)治疗组外周血中功能CD8~+T细胞的比例和促进肿瘤免疫因子分泌水平显著升高,而抑制性Treg细胞的比例以及抑制性肿瘤免疫因子分泌水平显著下降,说明DEX_(AFP)显著改善治疗小鼠免疫微环境。对相应肿瘤组织中T细胞数量和免疫因子水平的检测,发现DEX_(AFP)治疗组肿瘤组织中,CD8~+T细胞以及CD3~+T细胞浸润比例显著增加,而抑制性Treg细胞的聚集和抑制性免疫因子分泌显著下调。这些结果说明:DEX_(AFP)对原发性肝细胞癌具有显著抑瘤作用,并且能够改善原发性肝癌免疫和肿瘤微环境。为了阐明DEX_(AFP)抗肿瘤作用机制,我们利用胸腺缺陷的免疫缺陷型小鼠,通过检测DEX_(AFP)对T细胞缺失的免疫缺陷型裸鼠的肿瘤生长抑制效果和生存期作用,确认T细胞在DEX_(AFP)介导的抗肿瘤中的重要作用。同时,对NK细胞的检测,表明NK细胞可能在DEX_(AFP)介导的抗肿瘤过程中也起到一定作用。结论:表达肝癌特异性抗原的exosome对肝细胞癌表现为高效的抑瘤作用,并改善肝细胞癌免疫和肿瘤微环境,可以作为肝细胞癌免疫治疗的非细胞疫苗。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.7
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