Fucoxanthin抑制肿瘤诱导的淋巴管新生及机制研究

发布时间：2018-10-09 12:07

【摘要】：目的:肿瘤转移是肿瘤患者死亡主要原因之一。淋巴道转移多先于血道转移,是最为常见的转移方式。乳腺癌在女性恶性肿瘤中发病率居高位,淋巴道转移是乳腺癌主要转移途径。淋巴管新生是淋巴道转移的重要过程,包括淋巴管内皮细胞的增殖,迁移及管样结构的形成。在肿瘤转移中,肿瘤微环境的肿瘤细胞,间质细胞等协同作用,通过分泌促淋巴管生成因子诱导淋巴管生成。抑制肿瘤诱导的淋巴管新生,从而抑制肿瘤淋巴道转移成为新的靶点。岩藻黄素(fucoxanthin)主要来源于褐藻(如裙带菜Undaria pinnatifida等),属脂溶性类胡萝卜素,具有抗肿瘤、抗氧化、分解脂肪等多种药理活性,是极具应用潜力的海洋植物药源物质。血管内皮生长因子C(VEGF-C)是淋巴管特异性标志物,其与血管内皮细胞生长因子受体3(VEGFR3)为淋巴管新生的主要调节因子,它们的激活可诱导淋巴管内皮细胞(LECs)的增殖和迁移,促进淋巴管新生。PI3K/Akt/NF-кB信号通路主要促进细胞增殖,转移,激活通路上的靶蛋白,能促进肿瘤的发生发展。本研究从裙带菜中提取fucoxanthin,以人淋巴内皮细胞系HLEC为研究对象,采用细胞生物学、分子生物学及动物肿瘤模型,研究fucoxanthin对肿瘤诱导淋巴管新生的抑制作用,并探究其可能的机制。方法:1.MTT法检测fucoxanthin对HLEC细胞生长活力的影响,并采用流式细胞术检测fucoxanthin对HLEC细胞周期的影响。2.Transwell法检测fucoxanthin对HLEC细胞迁移能力的变化,且采用细胞骨架染色法检测fucoxanthin对HLEC细胞骨架结构的影响。3.采用体外实验检测fucoxanthin对HLEC管腔形成能力的影响。RT-PCR方法检测fucoxanthin对HLEC细胞中VEGF-C和VEGFR3 m RNA表达的影响,并采用western blot检测VEGFR3及VEGF-C蛋白水平变化;采用ELISA法检测fucoxanthin对p-VEGFR-3表达的影响(http://www.immunoway.com)。4.Western blot检测fucoxanthin对HLEC中NF-кB/PI3K/Akt信号通路的影响。5.MTT法检测fucoxanthin对MDA-MB-231细胞生长活力的影响6.Transwell法检测fucoxanthin对MDA-MB-231细胞迁移能力的影响7.Transwell、ELISA、western blot方法检测fucoxanthin对MDA-MB-231细胞侵袭能力及MMP-2,MMP-9,TIMP-1表达水平的影响8.ELISA、RT-PCR方法检测fucoxanthin对MDA-MB-231细胞VEGF-C分泌及m RNA水平的影响9.条件培养体系下,MTT、Transwell、成管、ELISA等方法检测条件培养下,HLEC细胞活力,迁移及淋巴管状结构形成及p-VEGFR-3表达的变化。10.采用MDA-MB-231细胞株建立裸鼠肿瘤模型,以裸鼠肿瘤组织为对象,双标免疫荧光法检测fucoxanthin对淋巴管密度(LVD)的影响。结果:1.MTT法检测结果显示fucoxanthin抑制HLEC细胞活力。流式细胞术结果表明,fucoxanthin阻滞HLEC细胞S期,从而抑制HLEC的增殖能力。2.Transwell法检测结果显示fucoxanthin诱导HLEC细胞迁移能力降低。骨架蛋白荧光实验表明,fucoxanthin处理下,细胞形态稍皱缩,伪足不明显,极性减弱。结果说明,fucoxanthin可以影响细胞骨架结构,从而使细胞运动能力下降。3.成管实验结果显示,fucoxanthin对HLEC细胞管状结构的形成具有抑制作用,呈剂量依赖性关系。RT-PCR和WB实验结果表明fucoxanthin抑制VEGF-C和VEGFR3蛋白和m RNA表达。ELISA实验结果表明fucoxanthin显著抑制p-VEGFR-3的表达。4.Western blot结果显示fucoxanthin处理组中p-PI3K,p-Akt和NF-κB蛋白表达下调。5.MTT法检测结果显示fucoxanthin抑制MDA-MB-231细胞活力。6.Transwell法检测结果表明fucoxanthin抑制MDA-MB-231细胞迁移能力。7.Transwell、ELISA、western blot方法检测结果显示fucoxanthin抑制MDA-MB-231细胞侵袭能力,同时MMP-2,MMP-9下调,TIMP-1表达上调。8.ELISA、RT-PCR方法检测结果显示fucoxanthin对MDA-MB-231细胞VEGF-C分泌量及m RNA表达均有明显抑制作用。9.条件培养体系下,MTT、Transwell、成管、ELISA等方法检测结果显示HLEC细胞活力,迁移及淋巴管样结构形成能力均在fucoxanthin处理下显著抑制,p-VEGFR-3表达显著降低。10.动物模型实验表明fucoxanthin能够抑制体内肿瘤淋巴管新生。结论:Fucoxanthin抑制HLEC的增殖、迁移及肿瘤诱导的淋巴管新生。Fucoxanthin通过调控VEGF-C的表达和分泌,钝化PI3K/Akt/NF-кB信号通路,从而抑制肿瘤诱导的淋巴管新生及淋巴道转移。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R730.5

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本文编号：2259277