胰腺星状细胞在胰腺癌化疗耐药中的作用及分子机制的研究

发布时间：2018-10-10 11:43

【摘要】：目的:探讨胰腺星状细胞(pancreatic stellate cell,PSC)及HGF/c-Met生物轴在胰腺癌(pancreatic cancer,PC)吉西他滨(gemcitabine,GEM)化疗耐药中的作用,从而为以PC肿瘤微环境为目标的靶向治疗提供新的突破点。方法:收集PSC和PC细胞的条件培养基(PSC-conditioned medium,PSC-CM;PCC-conditioned medium,PCC-CM)。用PSC-CM和化疗药物GEM处理PC细胞SW1990和PANC-1,观察PC细胞耐药表型的变化。采用细胞增殖与活性检测试剂盒(Cell Counting Kit 8,CCK-8)检测GEM对PC细胞的半数有效抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)和生长抑制率的变化,Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测GEM诱导的PC细胞的凋亡情况,蛋白质免疫印迹实验(Western Blot)检测PC细胞凋亡蛋白caspase 8和caspase 3的活化水平。应用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)和Western Blot以及细胞免疫荧光技术分析PC细胞EMT(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)过程中分子标记物上皮细胞钙黏蛋白(E-Cadherin)和波形蛋白(Vimentin)表达的变化。采用酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和qRT-PCR及Western Blot技术分别检测PSC和PC细胞中肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)的表达情况。用PSC-CM培养2种PC细胞,通过ELISA技术检测不同时间点PSC-CM中HGF的水平。通过Transwell技术共培养PSC和2种PC细胞,采用ELISA检测培养基中HGF的表达水平。利用外源性人重组HGF(Recombinant Human HGF,rhHGF)孵育PC细胞,采用qRT-PCR及Western Blot重新检测PC细胞中E-Cadherin和Vimentin的表达变化。应用ELISA分析HGF中和抗体AMG102对PSC-CM中HGF水平的影响。qRT-PCR及Western Blot分析PSC-CM及rhHGF对PC细胞内磷酸化的c-Met(p-c-Met)水平的影响。应用AMG102和c-Met特异性抑制剂PHA 665752分别阻断HGF/c-Met信号通路,Western Blot分析PC细胞内p-c-Met水平的变化,并观察加入AMG102和PHA 665752前后的PSC-CM对PC细胞化疗敏感性的影响及PC细胞EMT分子标记物的表达变化。最后观察PSC-CM及rhHGF对PC细胞内磷酸肌醇-3/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)通路的影响。应用PI3K/Akt特异性抑制剂LY294002阻断该通路后,Western Blot分析PC细胞内磷酸化的Akt(p-Akt)蛋白水平的变化,并重新检测PSC-CM对诱导PC细胞EMT及对PC细胞化疗抵抗的影响。结果:1.PSC增强PC细胞的化疗耐药性。CCK-8结果显示,相比于在正常培养基中生长的PC细胞,GEM对在PSC-CM中生长的SW1990和PANC-1细胞的IC50值显著升高,两者差异具有统计学意义(均P0.01)。而GEM对在PSC-CM中生长的PC细胞的生长抑制率则明显降低,两者差异具有统计学意义(均P0.01)。流式细胞术检测结果显示,在GEM作用下,相比于在正常培养基中生长的PC细胞,在PSC-CM中生长的PC细胞的凋亡率也明显降低,两者差异具有统计学意义(均P0.01)。Western Blot结果显示,PSC-CM显著降低了GEM诱导的PC细胞内caspase8和caspase 3的活化水平。2.PSC促进PC细胞发生EMT。qRT-PCR和Western Blot及细胞免疫荧光结果显示,PSC-CM能够下调PC细胞E-Cadherin的表达,上调Vimentin表达,两者差异具有统计学意义(均P0.01)。3.PSC高表达HGF。qRT-PCR和Western Blot分析显示,PSC高表达HGF,PC细胞则高表达c-Met,两者差异具有统计学意义(均P0.01)。ELISA结果显示,PSC-CM中HGF水平高于PCC-CM中,两者差异具有统计学意义(均P0.01)。并且在PC细胞的作用下,PSC-CM中HGF的水平呈时间依赖性的降低。ELISA结果也显示,AMG102能有效降低PSC-CM中HGF的水平,差异具有统计学意义(均P0.01)。此外,PC细胞能促进PSC分泌HGF,差异具有统计学意义(均P0.01)。Western Blot结果显示,PSC-CM及rhHGF均能促进PC细胞内c-Met的磷酸化水平。4.HGF/c-Met生物轴是促进PC细胞发生EMT的关键效应通路。qRT-PCR和Western Blot结果显示,rhHGF能促进PC细胞发生EMT,两者差异具有统计学意义(均P0.01)。此外,Western Blot结果显示,AMG102和PHA 665752均能有效地拮抗PSC-CM诱导的p-c-Met水平的增加,亦能减弱由PSC-CM诱导的EMT的发生。5.c-Met的活化增强了PC细胞的化疗抵抗能力。CCK-8结果显示,相比于在PSC-CM中生长的PC细胞,GEM对在含有PHA 665752的PSC-CM中生长的SW1990和PANC-1细胞的IC50值明显降低,两者差异具有统计学意义(均P0.01),而GEM对PC细胞的生长抑制率则升高,两者差异具有统计学意义(均P0.01)。流式细胞术检测结果显示,GEM对在含有PHA 665752的PSC-CM中生长的PC细胞的总体凋亡比例也显著增加,与PSC-CM组相比差异具有统计学意义(均P0.01)。Western Blot结果也显示,相比于在PSC-CM中生长的PC细胞,GEM诱导的在含有PHA 665752的PSC-CM中生长的PC细胞内caspase 8和caspase 3的活化水平明显升高。6.PSC经由HGF/c-Met生物轴活化PI3K/Akt信号通路从而促进PC细胞发生EMT和增强化疗抵抗。Western Blot分析显示,PSC-CM及rhHGF均能促进PC细胞内Akt的磷酸化水平,而LY294002则能抑制PSC-CM及rhHGF诱导的p-Akt水平增加。此外,LY294002还能协同PHA 665752抑制PSC-CM诱导的PC细胞EMT的发生。CCK-8结果显示,LY294002能抑制PSC-CM诱导的GEM对PC细胞的IC50值升高和生长抑制率的降低,差异均具有统计学意义(均P0.01)。结论:PSC高表达HGF,以旁分泌的方式与PC细胞的c-Met受体相结合,经由HGF/c-Met生物轴激活PC细胞内的PI3K/Akt信号通路,诱导PC细胞发生EMT,并通过降低PC细胞内caspase的活化水平抑制PC细胞凋亡,从而增强PC细胞对GEM的化疗抵抗。因此,PSC与PC细胞之间相互作用的靶向研究可能为克服PC化疗抵抗指明了新方向,针对HGF/c-Met生物轴及其下游信号通路的靶向治疗与GEM协同作用有可能改善PC患者的临床结局。
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【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.9

【参考文献】