沉默NF-κB通路IKKβ、p65基因对Hp感染过表达FAF1胃癌细胞的调控作用研究

发布时间：2018-10-10 12:37

【摘要】：目的：探讨核因子κB (nuclear factor-κB, NF-κB)信号传导通路中IKKβ、p65基因沉默后对过表达Fas相关因子1(Fas associated factor 1, FAF1)的HGC-27胃癌细胞的影响,以及NF-κB信号传导通路在幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)感染相关性胃癌中的作用,从而明确Hp感染相关性胃癌中FAF1与NF-κB信号传导通路之间的关系。方法：构建针对IKKβ、p65的siRNA慢病毒表达载体(LV-IKKβ-RNAi、 LV-p65-RNAi),转染过表达FAF1的HGC-27胃癌细胞珠(Lenti-FAF1/HGC-27),实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(Quantitative Real-time PCR, qRT-PCR)和蛋白质印迹(Western blot)法检测转染前后IKKP、p65、FAF1 mRNA和蛋白表达水平变化。应用CCK8法检测siRNA慢病毒转染后细胞增殖能力的变化。用Hp培养滤液感染经siRNA慢病毒转染的细胞,用qRT-PCR和Western blot法检测Hp感染前后IKKβ、p65、 FAF1mRNA和蛋白表达水平变化。进一步采用Western blot法检测Hp感染后NF-κB信号通路上IKKα/β、p65、IKBα及其相应磷酸化基因(P-IKKa/β, P-p65, P-IκBα)蛋白表达水平变化,酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测肿瘤坏死因子a (tumor necrosis factor-a, TNF-a)、白介素-8 (interleukin-8, IL-8)等炎性细胞因子浓度变化。结果：1.成功构建siRNA慢病毒表达载体LV-IKKβ-RNAi、LV-p65-RNAi和LV-NC-RNAi,测序结果表明,构建的重组序列是正确的。2.成功包装出所需要的慢病毒浓缩液,转染293T细胞后可见大量红色荧光产生。荧光法测定慢病毒滴度结果显示LV-IKKp-RNAi滴度为3×108TU/ml, LV-p65-RNAi滴度为6×108TU/ml, LV-NC-RNAi滴度为5×108TU/ml。3.细胞分别转染针对IKKβ和p65的siRNA慢病毒后,LV-IKKp-RNAi和LV-p65-RNAi组细胞原有的梭形形态变成不规则形,而空载转染组(LV-NC-RNAi)细胞形态未发生明显变化。转染后72 h,荧光显微镜下观察转染效率达到90%。4.细胞分别转染针对IKKβ和p65的siRNA'慢病毒后,LV-IKKβ-RNAi和LV-p65-RNAi组IKKβ和p65 mRNA表达显著低于LV-NC-RNAi组和未转染组(P均0.01)。LV-NC-RNAi组与未转染组IKKβ、p65 mRNA表达无显著差异(P0.05)。转染siRNA'慢病毒后,各组间FAF1 mRNA表达无显著差异(P0.05)5.Hp培养滤液感染后,LV-NC-RNAi组和未转染组IKKβ、p65 mRNA和蛋白表达都显著高于感染前(P0.01),而FAF1 mRNA和蛋白表达显著低于感染前(P0.01)；Hp感染后LV-IKKp-RNAi组和LV-p65-RNAi组IKKβ、p65、FAF1 mRNA和蛋白表达与感染前相比无显著差异(P0.05)。6.CCK8实验结果表明,与LV-NC-RNAi组和未转染组相比,LV-IKKp-RNAi组和LV-p65-RNAi组细胞增殖水平明显升高(P0.01),LV-NC-RNAi组和未转染组细胞增殖水平无显著差异(P0.05)。7.Hp培养滤液感染后,LV-IKKβ-RNAi、LV-p65-RNAi组NF-κB信号通路上IKKa/β、p65蛋白表达显著低于未转染组和LV-NC-RNAi组(P0.05),IκBα蛋白表达显著高于未转染组和LV-NC-RNAi组(P0.05);磷酸化IKKα/β、p65、IκBα(P-IKKα/β, P-p65, P-IκBa)蛋白表达显著低于未转染组和LV-NC-RNAi组(P0.05)。LV-NC-RNAi组和未转染组细胞蛋白水平无显著差异(P0.05)。8.Hp培养滤液感染后,LV-IKKp-RNAi、LV-p65-RNAi组炎性细胞因子TNF-α、IL-8浓度显著低于未转染组和LV-NC-RNAi组(P0.01)。LV-NC-RNAi组与未转染组TNF-α、IL-8表达无显著差异(P0.05)。结论：通过针对IKKβ和p65的siRNA慢病毒沉默NF-κB信号通路基因,能够影响过表达FAF1胃癌细胞的增殖,并抑制Hp感染引起的FAF1表达下调及IKKβ、p65表达上调；并且还能够抑制Hp感染调控的FAF1过表达胃癌细胞通路活化及相关细胞炎症反应。由此可见,Hp感染可能通过介导NF-κB信号通路下调抑癌因子FAF1的表达。这可能为将NF-κB通路作为胃癌的治疗靶点提供新的思路。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.2

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本文编号：2261797