244-MPT克服非小细胞肺癌吉非替尼耐药的分子机制研究

发布时间：2018-10-10 13:40

【摘要】：无论是在发达国家还是在发展中国家,癌症都已经成为威胁人类生命的一个主要的疾病。目前,癌症是美国的第二大死亡原因,并在未来几年内可能超越心脏病成为因病致死的首要原因。2012年全世界就有180万新增肺癌患者,约占当年诊断癌症的13%。2015年最新统计当中,肺癌在男性中将超越前列腺癌,在女性中将超越乳腺癌,成为最主要的癌症死亡原因。目前,我国的肺癌发病率及死亡率均排在所有恶性肿瘤首位,而且每年仍呈上升的趋势。87%的肺癌患者为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC),其五年生存率仅为18.2%。目前,对大多数早期的非小细胞肺癌患者可行手术治疗,对于失去于术时机的患者,则采取放化疗或靶向治疗的策略,其中靶向治疗对晚期非小细胞肺癌的重要性日益增加。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)在非小细胞肺癌发生发展中扮演着至关重要的作用,大约有40%-80%的非小细胞肺癌患者检测到EGFR异常高表达。同时在非小细胞肺癌中,EGFR往往发生突变。EGFR常见敏感突变也称为经典激活突变,包括外显子19的缺失突变和外显子21的L858R点突变,共占所有EGFR激活突变的90%左右。EGFR激活突变改变了激酶活性与非活性构象之间的平衡,使激酶构象不稳定,从而导致激酶的结构性激活。正因为EGFR在肿瘤发生中的重要作用,一系列EGFR酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor, TKIs),包括吉非替尼和厄洛替尼等被研发并作为有效的临床治疗手段用于EGFR敏感突变的患者。其作用机理为胞内酪氨酸激酶结构域中腺苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP)结合口袋被TKIs阻断,酪氨酸激酶结构域与TKIs结合后阻断配体诱导的受体自磷酸化,从而阻断了酪氨酸激酶活性,抑制胞内下游信号转导。然而,非小细胞肺癌患者在服用吉非替尼或厄洛替尼6-12个月后会出现EGFR TKIs继发耐药。吉非替尼继发耐药的机制繁杂,c-Met基因扩增、HER2基因扩增、K-Ras基因突变、PTEN缺失等都曾被报道过与TKIs原发或者继发耐药的发生相关。现有研究发现,有50%的吉非替尼继发耐药与EGFR的二次突变(主要为T790M突变)有关,表现为EGFR外显子20的二次突变,即在激酶结构域中790位点的苏氨酸被蛋氨酸取代。研究指出,EGFR蛋白外显子20中790位点的苏氨酸被认为是一个“门卫”残基,是决定TKIs在EGFR ATP结合口袋发挥特异性的一个重要因素。T790M突变导致TKIs继发耐药是由于该突变增加了EGFR对ATP的亲和力,减弱了TKIs与ATP竞争抑制激酶的效力。虽然由于TKIs治疗产生的耐药性与日俱增,但目前与之相应的对策却捉襟见肘。因此,发现一种可以作用于T790M突变的新型小分子化合物从而在非小细胞肺癌治疗中克服吉非替尼耐药具有非常迫切且重要的临床意义。本研究中,基于寻找治疗非小细胞肺癌并能够克服吉非替尼耐药的新型小分子化合物的目的,我们应用超级计算机筛选,在ZINC天然化合物数据库中筛选出了一个潜在的EGFR抑制剂,2-(4-(4-methoxyphenoxy)-lH-pyrazol-3-yl)-5-(p-tolylmethoxy)phenol (244-MPT)。我们发现这个小分子化合物在体外及体内实验中,通过作用于EGFR及其下游信号转导通路从而抑制吉非替尼敏感和耐药非小细胞肺癌细胞生长。更重要的是,我们发现在裸鼠移植瘤模型及非小细胞肺癌吉非替尼耐药的人组织来源的移植瘤模型中244-MPT能够有效抑制吉非替尼耐药肺癌肿瘤的生长。第一章244-MPT抑制非小细胞肺癌的锚定非依赖生长及细胞增殖方法1.利用超级计算机虚拟筛选模型寻找能够结合EGFR的候选靶点抑制剂。2.检测化合物244-MPT对肺正常细胞毒性。3.软琼脂克隆形成实验检测化合物244-MPT对于吉非替尼敏感和耐药非小细胞肺癌细胞系的锚定非依赖生长的影响。4.细胞增殖实验检测化合物244-MPT对于吉非替尼敏感和耐药非小细胞肺癌细胞系的增殖的影响。结果1.244-MPT具有潜在的同时抑制野生型及突变型EGFR激酶的能力根据超级计算机模拟筛选模型,我们得到一个根据对接打分程序给出的得分由高到低排名前十的针对野生型及突变型EGFR的抑制剂清单,根据清单综合排名,我们找到EGFR候选抑制剂244-MPT。2.244-MPT对正常肺成纤维细胞无明显毒性MTS实验结果表明：MRC-5肺正常细胞的增殖效率对照组与244-MPT处理组并无显著差异。这提示：244-MPT对MRC-5肺正常细胞并不具有显著的细胞毒性。3.244-MPT抑制吉非替尼敏感和耐药肺癌细胞的锚定非依赖生长软琼脂克隆形成实验结果表明：在吉非替尼敏感非小细胞肺癌细胞株HCC827中,化合物244-MPT在浓度为10μM时显著抑制了该细胞的克隆形成。而在吉非替尼耐药非小细胞肺癌细胞株H1975中,吉非替尼对H1975耐药细胞株的克隆形成能力无任何抑制作用,而244-MPT剂量依赖性抑制吉非替尼耐药肺癌细胞株的锚定非依赖生长。4.244-MPT抑制吉非替尼敏感和耐药肺癌细胞的增殖细胞增殖实验结果表明：化合物244-MPT浓度依赖性抑制吉非替尼敏感和耐药肺癌细胞株的生长,而吉非替尼对吉非替尼耐药非小细胞肺癌细胞株生长无任何作用。第二章244-MPT体外结合并抑制野生型及突变型EGFR蛋白激酶的活性方法1. 超级计算机模拟化合物244-MPT与靶标蛋白的相互作用。2.化合物244-MPT的EGFR蛋白激酶ATP竞争抑制实验。3.化合物244-MPT蛋白下拉实验。4.化合物244-MPT EGFR体外激酶活性实验。结果1 244-MPT与EGFR蛋白激酶的ATP结合区域结合超级计算机模拟实验证明：小分子化合物244-MPT与野生型及L858R/T790M双突变EGFR的ATP结合口袋存在相互作用,能与这一结构结合形成复合物。2 244-MPT与EGFR蛋白激酶的ATP结合区域结合,并竞争抑制ATPATP竞争实验结果证明：小分子化合物244-MPT作用于野生型及L858R/T790M双突变型EGFR的ATP结合口袋,并剂量依赖性竞争抑制ATP与EGFR的结合。3 244-MPT与EGFR蛋白在细胞水平结合蛋白下拉实验证明：小分子化合物244-MPT能与野生型及L858R/T790M双突变型EGFR相互作用,形成复合物。4 244-MPT体外抑制野生型及L858R/T790M双突变型EGFR激酶活性EGFR体外激酶实验结果显示：244-MPT对野生型及L858R/T790M双突变EGFR激酶活性具有明显抑制作用。这一结果说明,244-MPT确实能显著抑制EGFR的激酶活性。第三章244-MPT抑制EGFR激酶信号通路方法1. Western blot检测吉非替尼敏感和耐药非小细胞肺癌细胞株处理244-MPT对于EGFR激酶下游通路的影响。2.慢病毒转染法在人肺正常上皮细胞中过表达EGFR,建立稳定过表达细胞株。3.244-MPT处理EGFR过表达稳定细胞株,Western blot检测EGFR激酶下游通路。结果1.244-MPT抑制吉非替尼敏感和耐药肺癌细胞内EGFR信号转导通路的活化Western blot结果表明：244-MPT能显著抑制吉非替尼敏感和耐药肺癌细胞EGFR激酶的磷酸化,以及下游信号Akt及ERK1/2激酶的磷酸化。这提示：不论是吉非替尼敏感非小细胞肺癌细胞株还是吉非替尼耐药非小细胞肺癌细胞株,244-MPT均能够抑制细胞内EGFR信号转导通路的活化。2.慢病毒转染法建立人正常上皮细胞EGFR过表达稳定细胞系Western blot结果表明：NL20肺上皮细胞可过表达野生型及不同突变型EGFR,通过慢病毒转染可成功构建EGFR过表达稳定细胞系。3.244-MPT抑制不同基因型EGFR过表达细胞系内EGFR信号转导通路244-MPT能显著抑制不同基因型EGFR过表达细胞系EGFR激酶磷酸化,下游信号Akt及ERK1/2激酶的磷酸化。这提示：244-MPT能够抑制野生型、单突变型、亦或双突变型EGFR细胞株中EGFR信号转导通路的活化。第四章244-MPT诱导吉非替尼耐药非小细胞肺癌细胞株凋亡方法1. 流式细胞仪检测244-MPT处理吉非替尼耐药肺癌细胞株是否诱导其凋亡2. Western blot检测244-MPT处理吉非替尼耐药肺癌细胞株对凋亡信号的影响。3. TUNEL检测244-MPT处理吉非替尼耐药肺癌细胞株是否诱导其凋亡,导致细胞核碎裂。结果1.244-MPT诱导吉非替尼耐药肺癌细胞凋亡流式细胞仪结果表明：244-MPT能显著诱导吉非替尼耐药肺癌细胞凋亡2.244-MPT诱导吉非替尼耐药肺癌细胞凋亡,引起凋亡相关信号改变Western blot结果表明：244-MPT能够诱导凋亡,显著改变凋亡相关信号。3.244-MPT诱导吉非替尼耐药肺癌细胞凋亡,引起细胞核碎裂TUNEL结果证实：244-MPT引起吉非替尼耐药肺癌细胞核碎裂,导致细胞凋亡。第五章244-MPT抑制吉非替尼耐药非小细胞肺癌细胞的体内瘤体生长方法1. 利用吉非替尼耐药非小细胞肺癌细胞株H1975裸鼠移植瘤模型检测化合物244-MPT对吉非替尼耐药非小细胞肺癌的抗癌效果。2. 免疫组织化学检测吉非替尼耐药非小细胞肺癌细胞株H1975裸鼠异种移植瘤肿瘤组织EGFR、Akt、ERK1/2磷酸化水平及增殖标志Ki-67水平。结果1.244-MPT抑制吉非替尼耐药非小细胞肺癌细胞株H1975裸鼠移植瘤生长动物模型实验结果显示：裸鼠的体重并没有随着244-MPT给药有明显的降低或波动,且肿瘤的大小受到剂量依赖性抑制。而吉非替尼处理组无明显抑制。这些结果说明,244-MPT能在体内抑制吉非替尼耐药非小细胞肺癌移植瘤生长且无明显毒副作用。2.244-MPT体内抑制增殖指标Ki-67,以及EGFR、Akt和ERKl/2磷酸化免疫组织化学结果显示：与安慰剂对照组和吉非替尼处理组相比,244-MPT处理组Ki-67的表达明显被抑制,且EGFR、Akt和ERK1/2磷酸化水平显著下调。免疫组化的结果进一步证实了244-MPT抑制H1975移植瘤生长是通过抑制EGFR信号通路实现的。第六章244-MPT抑制非小细胞肺癌吉非替尼耐药的人组织来源的移植瘤生长方法1.建立非小细胞肺癌人组织来源的移植瘤模型及诱导构建其吉非替尼耐药模型。2.利用非小细胞肺癌吉非替尼耐药的人组织来源的移植瘤模型检测化合物244-MPT对吉非替尼耐药的非小细胞肺癌的抗癌效果。3.免疫组织化学检测非小细胞肺癌吉非替尼耐药的人组织来源的移植瘤增殖标志分子Ki-67, EGFR、Akt和ERK1/2磷酸化水平。结果1.244-MPT抑制非小细胞肺癌吉非替尼耐药的人组织来源的移植瘤生长动物模型实验结果显示：荷瘤小鼠随着244-MPT给药,肿瘤体积明显小于安慰剂对照组及吉非替尼处理组,且SCID小鼠的体重并没有随着244-MPT给药有明显的降低。而吉非替尼处理组对肿瘤生长无明显抑制。这些结果说明,244-MPT能够抑制非小细胞肺癌吉非替尼耐药的人组织来源的移植瘤生长且无明显毒副作用。2.244-MPT体内抑制增殖指标Ki-67,且抑制EGFR及ERK1/2磷酸化免疫组织化学结果显示：与安慰剂对照组和吉非替尼处理组相比,244-MPT处理组Ki-67的表达明显被抑制,且EGFR和ERK1/2磷酸化水平显著下调。免疫组化的结果进一步证实了244-MPT对非小细胞肺癌吉非替尼耐药的人组织来源的移植瘤的生长抑制与EGFR信号通路被抑制有关。结论1.计算机模拟、体外水平、细胞水平以及体内水平的研究结果证实：244-MPT直接作用于EGFR的ATP结合区域上,与EGFR结合,并通过ATP竞争的方式抑制其异常激活,继而抑制其下游信号转导通路,最终抑制吉非替尼敏感和耐药非小细胞肺癌的生长和增殖。2.吉非替尼耐药的非小细胞肺癌细胞株移植瘤及吉非替尼耐药的非小细胞肺癌人组织来源的移植瘤模型结果与细胞水平实验结果相一致。244-MPT能够有效抑制吉非替尼耐药的非小细胞肺癌的生长和增殖,且无明显毒副作用。这为非小细胞肺癌的分子靶向治疗提供了新的治疗选择。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2
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本文编号：2261994