IRX3在非酒精性脂肪性肝病和肝细胞癌中的作用及机制的研究

发布时间：2018-10-10 15:38

【摘要】：第一部分Irx3促进肝内脂质蓄积和肝脂肪变的研究目的：研究Irx3在肝内脂质代谢中的作用及其分子机制。方法：通过尾静脉注射过表达或沉默Irx3的腺病毒及对照腺病毒的方法,在小鼠体内上调或下调Irx3的表达,并给予正常或高脂饮食12周,检测小鼠肝组织学变化、脂质蓄积情况及脂滴相关蛋白的表达水平。在转染Irx3过表达腺病毒或对照腺病毒的小鼠肝细胞中,下调Fsp27β或Perilipin 1的表达,并给予400μmol/l油酸诱导,检测肝细胞内脂质蓄积情况。此外,我们使用染色质免疫共沉淀和报告基因荧光素酶检测等分子生物学的方法,研究Irx3是否能够转录激活Fsp27β或Perilipin1的表达。结果：上调肝内Irx3的表达可促进肝内脂质蓄积和肝脂肪变,以及增加Fsp27β和Perilipin 1的表达；相反,下调肝内Irx3的表达可抵抗高脂饮食诱导的肝脂肪变,降低Fsp27β和Perilipin 1的表达水平。但是脂滴相关蛋白Cidea、Cideb、Atg1、Cgi-58和Perilipin2-4的表达不受Irx3表达变化的影响。与对照腺病毒转染的肝细胞相比,Irx3过表达腺病毒转染的肝细胞内TG含量明显增加,但是在腺病毒介导的Irx3过表达的肝细胞内下调F sp27β或Perilipin 1的表达,导致细胞内TG含量显著性降低。染色质免疫共沉淀和报告基因荧光素酶检测结果显示,Irx3能与Fsp27β和Perilipin 1的基因启动子片段结合,而过表达Irx3增强Fsp27pβ和Perilipin 1的基因启动子报告基因的荧光素酶活性。结论：Irx3通过转录激活Fsp27β和Perilipin 1的表达,促进肝内脂质蓄积和肝脂肪变。第二部分IRX3在肝细胞癌中的作用及表达调控研究目的：研究IRX3在肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)中的作用,并从miRNA的角度探讨其表达调控机制。方法：采用qRT-PCR和Western blot方法检测HCC细胞系(HepG2和SMMC7721)和永生化肝细胞系L02中IRX3和miR-377表达水平：慢病毒转染HCC细胞构建IRX3稳定表达和沉默的稳定细胞株HepG2-shIRX3和SMMC7721-IRX3;采用CCK-8和克隆形成实验检测细胞的增殖和克隆形成能力；采用划痕实验和Transwell侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力;将miR-377 mimics或Control mimics转染入HCC细胞,QRT-PCR和Western blot方法检测miR-377对IRX3的调控作用：运用报告基因技术证实miR-377是否可直接结合IRX33'UTR;将]miR-377 mimics转染入SMMC7721-IRX3细胞,CCK8、克隆形成、划痕和Transwell实验观察miR-377是否能拮抗IRX3对细胞增殖、迁移和侵袭的促进作用。结果：HepG2和SMMC7721细胞中IRX3 mRNA和蛋白水平均显著高于L02细胞；CCK-8实验结果显示,与阴性对照相比,上调IRX3显著提高了SMMC7721细胞的生长,而下调IRX3抑制了HepG2细胞的生长；克隆形成实验显示,SMMC7721-IRX3细胞比对照细胞产生了更多的细胞克隆,HepG2-shIRX3细胞产生的细胞克隆少于对照细胞；划痕实验和Transwell实验显示,上调IRX3显著增强了SMMC7721的迁移和侵袭能力,而下调IRX3显著降低了HepG2细胞的迁移和侵袭能力；miR-377在HepG2和SMMC7721细胞中低表达：与转染Control mimics相比,转染了miR-377 mimics的HepG2和SMMC7721细胞中IRX3的蛋白表达水平明显降低,mRNA水平无明显差异;报告基因实验显示,miR-377显著降低了IRX3-3'UTR-WT的荧光素酶活性,而IRX3-3'UTR-MUT不受miR-377影响；miR-377过表达消除了过表达IRX3对SMMC7721细胞增殖、迁移和侵袭的促进作用。结论：IRX3在HCC细胞系中高表达,增强细胞增殖、迁移和侵袭能力：IRX3是niR-377的靶基因;HCC细胞中miR-377低表达可能导致了IRX3的高表达。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R575.5;R735.7

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本文编号：2262327