【摘要】：第一部分:FTO在人乳腺癌组织目的:分析乳腺癌组织与癌旁组织面FTO的表达差异,并探索FTO表达量与体重指数、肿瘤分期、组织分级、淋巴结转移、激素受体状态、HER-2状态等的关系。方法:1.收集样本:收集2012年1月至2013年12月在广西医科大学第一附属医院住院,经行手术切除的79例乳腺浸润性导管癌及43例癌旁组织蜡块标本。肿瘤标本均由病理医师确诊。所有患者均为女性,且术前患者未曾接受任何抗癌治疗。2.应用免疫组织化学方法检测79例乳腺癌组织及43例癌旁组织面FTO蛋白的表达情况,并比较其表达差异,分析其与乳腺癌临床病理参数的相关性。结果:1.FTO在乳腺癌组织与癌旁组织的表达情况:FTO在乳腺上皮及乳腺癌组织FTO在乳腺癌组织的表达水平要明显高于癌旁组织,差异有统计学意义(78.5%vs 27.9%,p0.001)。2.FTO与乳腺癌临床病理特征的关系:激素受体阴性或HER-2过表达患者的FTO表达水平要高于激素受体阳性或HER-2阴性患者(89.3%vs52.2%,p=0.001;97.2%vs 63.7%,p0.001)。乳腺癌组织分级为3级或P53阳性的患者其FTO表达水平似乎要高于组织分级低(1级或2级)或P53阴性的患者,差异接近达到统计学意义(100%vs75%,p=0.082;90.9%vs 73.8%,p=0.077)。FTO蛋白的表达情况与乳腺癌TNM分期、年龄、淋巴结转移状态、Ki67指数及体重指数(BMI)无明显相关性(所有p值0.05)。3.FTO在不同乳腺癌分子分型中的表达情况:FTO在HER-2过表达乳腺癌中表达水平最高(97.1%),其次是三阴型乳腺癌(76.2%),最后是Luminal A/B1型乳腺癌(52.2%),三者间差异达到统计学意义(p0.001)。结论:1.FTO在乳腺癌组织的表达水平要高于癌旁组织;且激素受体阴性或HER-2过表达患者的FTO表达水平要高于激素受体阳性或HER-2阴性患者;乳腺癌组织分级为3级或P53阳性的患者其FTO表达水平似乎要高于组织分级低(1级或2级)或P53阴性的患者。2.FTO在不同分子分型乳腺癌中的表达有差异:FTO在HER-2过表达乳腺癌中表达水平最高(97.1%),其次是三阴型乳腺癌(76.2%),最后是Luminal A/B1型乳腺癌(52.2%)。3.我们的研究结果提示FTO可能在乳腺癌,尤其是HER-2过表达乳腺癌的发生、发展中起有重要作用。第二部分:FTO在人乳腺癌细胞株MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-231及乳腺上皮细胞HBL-100中的表达情况目的:分析不同分子类型人乳腺癌细胞株中FTO基因的表达,找出优势表达株,为后面进一步研究FTO在人乳腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭中的作用及其机制奠定基础。方法:1.应用蛋白质免疫印迹方法检测MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-231及HBL-100细胞中FTO蛋白表达情况。2.应用实时荧光定量PCR测定MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-231及HBL-100细胞中FTO m RNA的表达。结果:1.实时荧光定量PCR的检测结果发现,FTO在ER阴性人乳腺癌细胞SK-BR-3及MDA-MB-231的m RNA表达水平要高于乳腺上皮细胞HBL-100,差异有统计学意义(p=0.049,p=0.001);而FTO在MCF-7与HBL-100细胞之间表达无差异(p0.05)。2.蛋白质免疫印迹结果发现,在人乳腺癌细胞株MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-231及作为对照的乳腺上皮细胞HBL-100中均检测到了FTO蛋白的表达,在SK-BR-3中FTO表达最高,其次是MDA-MB-231、MCF-7,HBL-100表达水平最低。四组间FTO蛋白表达的差异具有统计学意义(p0.05)。结论:1.ER阴性人乳腺癌细胞株SK-BR-3、MDA-MB-231中FTO蛋白水平和m RNA水平的表达均高于乳腺上皮细胞HBL-100中的表达。2.结合前期的免疫组化结果,我们选择SK-BR-3细胞作为FTO的优势表达株,进一步行以FTO为研究靶点的生物学功能试验。第三部分基于CRISPR/Cas9技术建立FTO基因敲除的SK-BR-3细胞目的:利用CRSPR/Cas9技术建立FTO基因敲除的SK-BR-3细胞系,旨在建立研究FTO的平台,为探索FTO对SK-BR-3细胞生物学行为的影响及其分子机制夯实前期基础。方法:根据CRISPR/Cas9基因敲除试剂盒操作流程构建g RNA重组质粒,利用Lipofectamine2000脂质体介导质粒转染细胞,通过GFP绿色荧光及嘌呤霉素对转染细胞进行筛选,并鉴定敲除效果。结果:1.根据CRISPR/Cas9系统sg RNA的设计原则,应用http://crispr.mit.edu网站进行辅助Cas打靶位点设计,设计了3个打靶位点:FTO sg RNA#1,GGAACGAGAGCGCGAAGCTAAGG;FTO sg RNA#2,GCGCGAAGCTAAGGTATGTCGGG;FTO sg RNA#3,GCTAAGGTATGTCGGGCTCCCGG。2.体外活性检测提示FTO sg RNA#3的酶切效率最高,达90%,选择用于后续实验。3.构建了g RNA重组质粒,并测序成功。4.脂质体介导sg RNA#3重组载体感染SK-BR-3细胞。嘌呤霉素与绿色荧光蛋白对转染后的细胞进行了筛选。5.测序与蛋白质免疫印迹方法从DNA和蛋白水平鉴定FTO敲除成功。结论:本实验通过CRISPR/Cas9技术成功获得了FTO基因敲除的SK-BR-3细胞。该细胞用于后续研究FTO表达对细胞生物学行为能力的影响。第四部分FTO基因敲除对SK-BR-3细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响目的:探索FTO表达改变对SK-BR-3细胞生物学行为能力的影响。方法:1.应用CCK-8细胞增殖实验及克隆形成实验检测FTO基因敲除前后细胞增殖能力的变化;2.应用划痕实验及迁移实验检测FTO基因敲除前后细胞迁移能力的变化;3.应用Transwell侵袭实验检测FTO基因敲除前后细胞体外侵袭能力的变化。结果:1.CCK-8细胞增殖实验及克隆形成实验发现,FTO基因敲除后,SK-BR-3细胞的增殖能力没有改变(p0.05);2.划痕实验及transwell实验发现,FTO基因敲除后,SK-BR-3细胞的迁移、侵袭能力下降(p0.01)。结论:本研究发现FTO表达水平改变可影响SK-BR-3细胞的迁移、侵袭能力,这结果将可能为乳腺癌的治疗提供新思路。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.9
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本文编号：2272576
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