EVI1高表达急性髓系白血病的临床、细胞遗传学特征和初步发病机制研究

发布时间：2018-10-17 17:09

【摘要】：【目的】1、分析2007年1月至2015年4月期间于本中心经形态学、免疫学、细胞遗传学分型(MIC)确诊并住院接受治疗的447例初诊急性髓系白血病(AML)患者的EVI1表达水平,分析其临床和细胞遗传学等特征,对EVI1高表达患者的细胞遗传学特征进行深入分析。2、对151例处于第一次缓解期行清髓性异基因造血干细胞移植患者的EVI1表达特征和临床意义进行分析,分析EVI1基因表达水平对患者预后的影响。3、采用基因芯片等技术手段筛选与EVI1高表达相关的微小RNA(micro RNA),并初步探讨11p15重排导致EVI1高表达的机制。【方法】1、通过制备质粒标准品的方法建立EVI1绝对定量检测的方法。利用建立的RQ-PCR方法对本中心447例初诊AML患者的EVI1水平进行检测,并收集患者的人口学、初诊血细胞计数、形态学、细胞遗传学和AML常见基因突变等资料;并对缓解率和缓解后的无白血病生存进行分析。2、回顾性分析了151例处于第一次缓解期接受清髓性异基因造血干细胞移植的AML患者,分析其临床特点、移植类型、EVI1表达水平、细胞遗传学特征和基因突变类型对患者预后的影响,并进行单因素和多因素的统计学分析。3、通过micro RNA表达谱分析研究与EVI1相关的micro RNA的水平变化并对显著负相关的两种micro RNA进行验证以及靶基因预测;利用基因表达谱和RQ-PCR研究11p15重排的AML高表达EVI1的特点,并通过体外转染试验初步揭示11p15重排和EVI1高表达之间的联系。【结果】1、成功构建了EVI1定量检测的标准品,验证了RQ-PCR的工作曲线,对正常骨髓单个核细胞的EVI1表达进行了检测,分别为EVI1-1d:99.812±94.823/10000PBGD,MDS1EVI1:186.171±188.678/10000PBGD,c EVI1:1198.428±1266.043/10000PBGD(均值±标准差),界定了EVI1高低表达的界线值为10倍正常骨髓的均值。在447例初诊AML中,EVI1高表达者为80例(占17.9%),EVI1低表达者为367例(占82.1%)。两组的年龄、性别分布无明显差异,两组外周血血红蛋白水平、白细胞计数、血小板计数均未见到明显差异。形态学方面,M5和M6在EVI1高表达组显著增多(p=0.0038和0.01),M3在低表达组中有增多的趋势(p=0.08)。细胞遗传学方面,显著倾向于EVI1高表达组分布的核型为11q23/MLL重排、3q26重排、-7/7q-以及t(9;11)(p分别为0.0001,0.0001,0.0006,0.0135),尤其发现了5例存在重现性11p15重排的病例均伴有EVI1高表达(p0.0001)。扩大验证后的12例11p15重排均发现EVI1高表达。而显著倾向于在EVI1低表达组占优势的核型为正常核型、inv(16)、t(8;21)(p=0.001,0.009,0.002)。按照细胞遗传学危险度的分组分布中,低中高危组均显示两组分布的显著性差异(p0.0001,p=0.044,p0.0001),其中低、中危组在EVI1低表达组显著占优势,而高危组则在EVI1高表达组占优势。AML常见突变方面,NPM1突变更倾向于分布于EVI1低表达组(p=0.0003)。结合了细胞遗传许和分子突变特征的NCCN 2014关于AML危险度的分层,高危组更倾向分布于EVI1高表达组(p0.0001),而低危组倾向分布于EVI1低表达组(p0.0001)。对于≤60岁的患者,EVI1高表达组缓解率明显低于EVI1低表达组,两组CR率分别为37.5%v.s.69.4%,存在显著性统计学差异(p0.0001)。两组缓解后的无白血病生存也显示类似趋势(p=0.031)。对于11q23/MLL重排,高EVI1表达在M5亚型多见,但无明显统计学意义(p=0.231),而t(11;19)(q23;p13)和t(6;11)(q27;q23)核型在EVI1高表达组显示出优势的趋势(p=0.077)。11q23/MLL重排中,EVI1高表达组的缓解率显示出明显低于低表达组的趋势(p=0.061)。-7/7q-核型中,单独-7占EVI1高表达组的比例更高(4/7),两组的完全缓解率未见显著性差异。应用FISH技术,发现3q26重排存在多种断裂重排方式,并发现5例3q27、3q29重排为隐匿性3q26重排。2、151例处于第一次缓解期行清髓性异基因造血干细胞移植的患者中,EVI1高表达组和低表达组比较,年龄、性别、初诊时外周血白细胞计数、骨髓原始细胞比例均无明显差异;M5分型在高表达组更占优势(p=0.0015);细胞遗传学构成上,11q23/MLL重排在高表达组更占优势(p0.0001),正常核型在低表达组更占优势(p0.0001)。细胞遗传学危险度中低危组占EVI1低表达组的比例更高(p0.0001)。常见的AML突变在两组构成中无明显差异。EVI1高表达和低表达组接受不含照射的MAC方案的比例、接受亲缘或无关供体的人数比、接受骨髓干细胞外周血造血干细胞和脐带血干细胞来源的构成比均未见显著统计学差异。而在接受骨髓和外周血造血干细胞混合输注方面,EVI1高表达组为14例(44%)显著高于EVI1低表达组(p=0.0039)。在HLA匹配情况方面,采用部分相合供体的EVI1高表达组患者例数为16例(50%),显著高于EVI1低表达组(p=0.0333)。移植后所有患者均获得造血重建,移植后1个月均获得完全嵌合。100天内累积a GVHD(II-IV°)发生率为21%±5%,7例患者发生重度a GVHD(III-IV°)。累积c GVHD发生率为30%±10%。15例患者2年内出现广泛型c GVHD。患者2年总体生存率为68.5%(59.9-76.5%);无事件生存率为67.4%(58.5-74.6%)。中位随访时间26个月(2-60个月)。EVI1高表达组24个月OS为52.8%(32.5-69.5%),较低表达组72.4%(63-80%)显著降低(p=0.0122);LFS为56.7%(34.9-73.7%),同样较低表达组76.1%(66.6-83.2%)显著降低(p=0.0083)。以无复发死亡作为竞争性因素,EVI1高表达组24个月时的累积复发率显著高于低表达组,分别为39.5%(20.9-57.6%)和22.5%(15.2-30.7%)(p=0.013)。针对LFS进行的单因素分析结果表明,EVI1低表达和中危的细胞遗传学分组是有利于LFS的预后因素(p0.05),而针对OS进行的单因素分析表明,更低的年龄、EVI1低表达、ITD野生型、中低危的细胞遗传学、NPM1野生型均为有利于OS的预后因素(p均0.05)。多因素分析结果表明,EVI1表达为LFS唯一的独立预后因素,低表达有利于预后(HR=0.44,95%CI 0.23-0.84,p=0.014)。ITD突变和低危、中危的遗传学分型为OS的独立预后因素。野生型ITD有利于预后(HR=0.31,95%CI 0.15-0.63,p=0.001);低危核型利于预后(HR=0.11,95%CI 0.01-0.86,p=0.03),中危核型同样有利于OS(HR=0.43,95%CI 0.24-0.78,p=0.005)。以NCCN 2014关于AML危险度分层取代细胞遗传学分组和常见AML突变的单因素分析表明,EVI表达高低以及中危的NCCN分组对LFS的预后有显著性影响,而多因素分析表明,仅有NCCN中危险度组为有利于OS的唯一有利因素(HR=0.37,95%CI 0.21-0.64,p=0.0004)。基于细胞遗传学分层对EVI1的分层分析表明,EVI1表达状态对LFS和OS均未产生明显影响。3、结合107例初诊AML的micro RNA表达谱分析以及EVI1定量分析,筛选出与EVI1表达负相关的micro RNA为mi R-181a(Fold change 0.368,p=0.00018)、mi R-128b(Fold change 0.465,p=0.002)、mi R-181c(Fold change 0.470,p=0.001)、mi R-128a(Fold change 0.479,p=0.002),正相关的为mi R-151-3p、mir-500、mi R-143、mi R-199a-5p、mi R-363、mi R-148a、mi R-151-5p、mi R-125a-5p、mi R-99b。利用RT-PCR方法对验证了71例初诊AML的mi R-128a的相对表达在EVI1高表达和低表达组中存在显著性差异(p=0.0015),mi R-181a的相对表达存在显著性差异(p=0.05)。利用Targetscan预测mi R-128a的可能调节靶基因为HOXA9等HOX家族成员,mi R-181a的可能调节靶基因为Bcl-2。10例11p15重排的AML基因表达谱表明EVI1d型是NUP98重排白血病患者表达上调的主要形式,而ME(MDS1EVI1)剪接型表达则处于低水平。HOX家族中,HOXA3、HOXA4、HOXA5、HOXA7、HOXA9、HOXA10、HOXAB处于较高表达水平。RQ-PCR验证证实8例t(7;11)((p15;p15)的EVI1表达中,c EVI1、EVI-1d升高,而MDS1/EVI1表达无明显升高。利用NUP98/HOXA9、NUP98/HOXD8对K562细胞和293T细胞的转染表明,NUP98/HOXA9对293T细胞的转染后c EVI1的相对表达有所上升。通过构建的连接NUP98/HOXA9不同结构片段和EVI1启动子区的荧光素酶报告系统发现GLFG段对EVI1启动子活性有显著影响。【结论】1、EVI1高表达在AML中发生率为17.9%,在M5中较为多见,常见的细胞遗传学异常包括11q23/MLL重排、3q26重排、-7/7q-以及t(9;11)和11p15重排。高表达组缓解率明显降低,这一趋势同样表现在单独进行的11q23/MLL重排患者中。2、处于第一次完全缓解期接受清髓性异基因造血干细胞移植的AML患者,初诊时EVI1高表达患者的无白血病生存率、总体生存率、累积复发率明显差于低表达患者,EVI1是影响无复发生存的独立预后因素。3、与EVI1表达负相关的micro RNA为mi R-128a,mi R-181a,预测的调控靶基因为HOXA9和Bcl2等。11p15致EVI1高表达的剪切体类型有独特特征,利用NUP98/HOXA9转染293T细胞后可导致EVI1表达上升。重组质粒转染发现GLFG段对EVI1启动子活性有显著影响。
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【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R733.71

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