表观遗传学调控下DACH1的表达沉默通过激活TGF-β信号通路促进胃癌的侵袭转移

发布时间：2018-10-19 13:28

【摘要】：背景胃癌是最常见恶性肿瘤之一,是癌症相关死亡的主要原因。2012年新增胃癌病例数为951600,723100人死于胃癌。多数胃癌患者死于复发和转移,5年生存率较低。TGF-β信号通路的激活可通过诱导上皮向间质的转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)促进肿瘤侵袭和转移。DACH1在多种肿瘤中表达降低,其表达在肝癌和结肠癌中被证明受启动子区甲基化调控。研究报道DACH1可以抑制TGF-β信号通路在乳腺癌和结肠癌中的异常激活。目的本研究的目的是探讨DACH1在胃癌中的表达改变及甲基化调控,明确胃癌中DACH1的甲基化在胃癌诊断、预后判断和化疗敏感性方面的潜在应用价值。通过研究DACH1对TGF-β信号通路活性的调控,探讨DACH1对于胃癌细胞EMT、侵袭、迁移能力的影响,明确DACH1在胃癌发生中的作用及机制。方法RT-PCR用于检测DACH1在胃癌细胞系中的表达及5-aza (5-aza-2'-deoxycytidine)去甲基化处理后DACH1的表达恢复：应用MSP(甲基化特异性PCR)检测胃癌细胞系、正常胃黏膜组织、胃癌癌旁组织和胃癌组织中DACH1的甲基化改变。应用SPSS15.O软件分析DACH1甲基化和胃癌患者临床病理特点间的相关性。免疫组织化学(IHC)方法分析胃癌和癌旁组织中DACH1表达水平,分析DACH1勺表达与甲基化的相关性。荧光素酶报告基因系统和western blot检测DACH1对TGF-β信号通路活性及下游蛋白(Smad2/3、p-Smad2/3、E-cadherin、vimentin、MMP2和MMP9)的影响：应用CCK-8、克隆形成、流式细胞术及裸鼠成瘤的实验研究DACH1对胃癌细胞增殖、生长的影响。结果DACH1的表达沉默或降低的胃癌细胞系,其DACH1启动子区发生高甲基化,经去甲基化药物5-aza处理后可恢复表达。胃癌组织中DACH1甲基化率为63.3(62/98)：癌旁组织中DACH1的甲基化率为38%(19/50),而在正常胃黏膜组织中未发现DACH1的甲基化(0/8例)。DACH1甲基化与胃癌组织中DACH1的表达降低(p0.01)、肿瘤分级(p0.01)和淋巴结转移相关(p0.05)。DACH1通过抑制TGF-β信号通路而抑制胃癌细胞的迁移、侵袭；DACH1能够抑制胃癌细胞的EMT、下调基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的表达。DACH1恢复表达后可将胃癌细胞阻滞在G2/M期,抑制胃癌细胞的增殖和克隆形成,增加胃癌细胞对多西他赛(docetaxel)的敏感性。DACH1恢复表达的胃癌细胞的成瘤能力明显减低,瘤体体积和重量均低于对照组。结论DACH1甲基化是胃癌的频发事件,DACH1甲基化与胃癌的预后和转移相关。DACH1的表达受甲基化调控。DACH1在体内、体外抑制胃癌细胞的生长。DACH1可通过抑制TGF-β言号通路而抑制胃癌细胞的迁移和侵袭。DACH1甲基化是胃癌对多西他赛耐药的标志物。
[Abstract]:Background gastric cancer is one of the most common malignant tumors and the main cause of cancer-related deaths. Most gastric cancer patients died of recurrence and metastasis, and the 5-year survival rate was low. Activation of TGF- 尾 signaling pathway could induce epithelial to interstitial transformation (epithelial-mesenchymal transition, EMT) promoted tumor invasion and metastasis. DACH1 expression was decreased in many tumors. Its expression has been demonstrated to be regulated by promoter methylation in liver and colon cancer. It is reported that DACH1 can inhibit the abnormal activation of TGF- 尾 signaling pathway in breast and colon cancer. Objective to investigate the expression and methylation regulation of DACH1 in gastric cancer, and to determine the potential value of DACH1 methylation in the diagnosis, prognosis and chemosensitivity of gastric cancer. By studying the effect of DACH1 on the activity of TGF- 尾 signaling pathway, the effect of DACH1 on the invasion and migration of gastric cancer cell line EMT, was investigated, and the role and mechanism of DACH1 in gastric carcinogenesis were clarified. Methods RT-PCR was used to detect the expression of DACH1 in gastric cancer cell lines and the recovery of DACH1 expression after 5-aza (5-aza-2'-deoxycytidine) demethylation. MSP (methylation specific PCR) was used to detect the expression of DACH1 in gastric cancer cell lines and normal gastric mucosa. Methylation of DACH1 in paracancerous and gastric cancer tissues. The correlation between DACH1 methylation and clinicopathological features of gastric cancer was analyzed by SPSS15.O software. Immunohistochemical (IHC) method was used to analyze the expression of DACH1 in gastric cancer and adjacent tissues, and the correlation between the expression of DACH1 and methylation was analyzed. Luciferase reporter gene system and western blot were used to detect the effects of DACH1 on the activity of TGF- 尾 signaling pathway and downstream proteins (Smad2/3,p-Smad2/3,E-cadherin,vimentin,MMP2 and MMP9). The effects of DACH1 on the proliferation and growth of gastric cancer cells were studied by CCK-8, clone formation, flow cytometry and tumorigenesis in nude mice. Results the expression of DACH1 in gastric cancer cell lines with silencing or decreasing expression was hypermethylated in the DACH1 promoter region, and could be recovered after treatment with demethylating drug 5-aza. The methylation rate of DACH1 in gastric cancer was 63.3 (62 / 98): the methylation rate of DACH1 was 38% (19 / 50) in paracancerous tissues, but no methylation of DACH1 was found in normal gastric mucosa (0 / 8 cases). DACH1 methylation was associated with decreased expression of DACH1 (p0.01), tumor grade (p0.01) and lymphocytosis in gastric cancer tissues. DACH1 inhibits the migration of gastric cancer cells by inhibiting TGF- 尾 signaling pathway (p0.05). DACH1 could inhibit the expression of matrix metalloproteinase MMP-2 and MMP-9 in gastric cancer cells by EMT, down-regulation. When DACH1 returned to the expression level, it could block gastric cancer cells to G2 / M phase, and inhibit the proliferation and clone formation of gastric cancer cells. The sensitivity of gastric cancer cells to docetaxel (docetaxel) was increased. The tumorigenic ability of gastric cancer cells recovered from DACH1 was significantly decreased, and the tumor volume and weight were lower than those of the control group. Conclusion DACH1 methylation is a frequent event in gastric cancer. DACH1 methylation is associated with the prognosis and metastasis of gastric cancer. The expression of DACH1 is regulated by methylation. DACH1 in vivo. DACH1 can inhibit the migration and invasion of gastric cancer cells by inhibiting TGF- 尾 pathway in vitro. DACH1 methylation is a marker of docetaxel resistance in gastric cancer.
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.2

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本文编号：2281263