肿瘤源性组织因子活化补体在肺癌中的作用及机制研究

发布时间：2018-10-20 08:46

【摘要】：研究背景肺癌是我国发病率和死亡率最高的实体肿瘤,非小细胞肺癌(NSCLC)占总肺癌的80%,其病因至今尚不完全明确。近期研究表明,慢性炎症在肺癌的发生及发展过程中发挥重要作用。因此深入阐明慢性炎症在肺癌发生发展过程的作用及机制将会有利于完善肺癌发展理论,也将会为肺癌防治提供新思路、新靶标。肺癌患者体内可见补体的大量活化。肿瘤微环境中补体C5裂解产物可以通过诱导肿瘤形成免疫耐受,直接调控肿瘤细胞增殖、转移以及介导内皮细胞血管生成等方式促进肿瘤发生及发展。然而肺癌患者体内补体的活化途径尚未阐明,这一机制的阐明将为靶向补体的肺癌防治提供有力的支持。肿瘤细胞可以通过异常表达组织因子(tissue factor, TF),获得活化凝血系统的能力,引起肺癌、胰腺癌、胃癌等患者处于高凝状态,引发一系列静脉血栓相关并发症。近期有研究报道,凝血系统活化产物凝血酶、Ⅸ因子、Ⅹ因子和Ⅺ因子均可以直接裂解补体,引起补体的活化。但是在肿瘤微环境中尚无这一现象及其作用的报道。本课题着眼于探讨在肿瘤微环境中肿瘤源性TF介导的凝血活化与补体系统的相关作用以及其在肺癌发展中的影响及机制。因此,该工作能够完善肿瘤微环境中补体活化的理论,为肺癌的临床治疗研究提供新的思路研究方法1.检测肿瘤细胞株TF表达及其对活化凝血能力的影响PCR检测人肺腺癌细胞株A549、人乳腺癌细胞株T47D、人卵巢癌细胞株A2780、人胃腺癌细胞株AGS、人大细胞肺癌细胞株H460的TF表达水平。使用慢病毒下调A549细胞株TF表达,构建A549-shTF细胞株及对照细胞株A549-vec; PCR和Western Blot检验TF下调程度。使用人乏血小板血浆检测A549细胞株、A549-shTF细胞株及A549-vec细胞株诱导血浆凝固能力,检测凝血酶原时间(prothrombin Time, PT)。2.分析下调TF表达对肺癌细胞株A549的生物学特性影响CCK-8检测A549细胞株、A549-shTF细胞株及A549-vec细胞株体外增殖潜能;流式细胞术检测A549细胞株、A549-shTF细胞株及A549-vec细胞株有丝分裂相关分子Ki-67表达水平;流式细胞术检测A549细胞株、A549-shTF细胞株及A549-vec细胞株凋亡相关标记Annexin V和PI染色水平。3.下调TF对A549细胞株裸鼠体内肿瘤生长及肿瘤微环境内凝血水平的影响使用A549-shTF细胞株及A549-vec细胞株构建裸鼠移植瘤模型,观察肿瘤生长;免疫组织化学(IHC)染色检测肿瘤组织石蜡切片中TF表达水平和纤维素沉积程度。4.下调TF延缓A549细胞株移植瘤生长的机制研究IHC染色检测肿瘤石蜡切片中补体活化产物C3b/iC3b/C3c和C5b-9沉积水平;流式细胞术检测肿瘤组织中CD 11 b+Gr-1 +髓系抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSC)浸润比例;使用C5a受体拮抗剂干预MDSC向肿瘤组织中的募集,观察A549-shTF细胞株及A549-vec细胞株在裸鼠体内移植瘤生长。研究结果1. TF的表达决定了肿瘤细胞活化凝血系统的能力PCR结果显示人肺腺癌A549细胞株表达较高水平的TF;通过慢病毒下调A549细胞的TF表达并使用PCR、Western Blot验证,构建了稳定的低表达TF的细胞株A549-shTF和对照细胞株A549-vec;体外诱导乏血小板血浆凝固实验显示A549细胞株和A549-vec细胞株具有相同的促凝活性,而A549-shTF细胞株的促凝活性明显减弱。2. TF的表达不影响肺癌细胞的增殖潜能和凋亡比例CCK-8实验显示,A549细胞株、A549-shTF细胞株及A549-vec细胞株具有相同的体外增殖潜能;流式细胞术显示:(1)A549细胞株、A549-shTF细胞株及A549-vec细胞株Ki-67表达水平相同,(2) A549细胞株、A549-shTF细胞株及A549-vec细胞株中Annexin V+PI-细胞比例相近。3.下调TF表达延缓肺癌细胞体内肿瘤生长并减弱局部凝血活化程度A549-shTF细胞形成的裸鼠皮下移植瘤的体积和重量均小于A549-vec细胞株来源的裸鼠皮下移植瘤。同时,IHC染色显示A549-shTF组肿瘤组织中TF的表达水平和纤维素沉积量小于A549-vec组。4. TF介导的补体活化增强了 MDSC向肿瘤组织的募集并促进肿瘤生长IHC染色显示A549-shTF组肿瘤组织中补体活化产物C3b/iC3b/C3c和C5b-9沉积量低于A549-vec组;流式细胞术结果显示A549-shTF组肿瘤组织中MDSC细胞浸润比例低于A549-vec组。拮抗C5a受体后,A549-vec组裸鼠皮下移植瘤的生长速度下降至与A549-shTF组相同,MDSC的浸入比例也下降至与A549-shTF组无差异。研究结论1.肺癌细胞株A549具有活化凝血系统的能力;TF是A549细胞活化凝血能力的关键分子。2.下调A549细胞的TF表达不会影响细胞在体外的增殖潜力和细胞的凋亡比例。3.下调TF的表达,延缓了肺癌细胞在裸鼠体内的生长速度,减弱了肿瘤微环境中的凝血活化程度。4.减少肿瘤组织中TF的表达能够减轻肿瘤微环境中补体的活化并降低肿瘤组织中的MDSC的比例;拮抗C5a受体引起的MDSC的募集减少可以抵消肿瘤源性TF促进肿瘤生长的能力。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R734.2

【参考文献】