DNA修复蛋白Ku80在肺腺癌的表达及对顺铂加培美曲塞联合化疗的化疗敏感性研究

发布时间：2018-10-21 13:14

【摘要】：研究背景与目的肺癌是全世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,其五年生存率仅为15.9%。在肺癌的所有组织学分型当中,腺癌已经成为一种最常见的组织学类型。由于健康查体并未完全普及,对于大多数患者而言,当被确诊患有肺恶性肿瘤时,根据UICC癌症TNM分期,肿瘤已处于中晚期。对于ⅢA期非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)患者,因为外科医生无法完全切除所有可能存在转移的淋巴结组织,所以单纯进行手术治疗的疗效并不令人满意。根据NCCN指南,对于ⅢA期NSCLC患者,应在手术前先进行两个周期的新辅助化疗,只有当肿瘤明显缩小且肿瘤对侧纵膈淋巴结完全消失,手术才能作为后续的治疗手段。因此,新辅助化疗作为针对中晚期肺癌患者的例行治疗手段,在世界范围内被广泛认可。其中,铂类联合培美曲塞是针对肺腺癌的一线新辅助化疗方案。然而,当新辅助化疗两个周期后,复查CT评估化疗疗效时发现,只有少部分肺腺癌患者可以取得理想的治疗效果。由于肿瘤的耐药性及异质性,顺铂联合培美曲塞化疗方案所取得的疗效具有显著的个体差异。临床急需探寻肺腺癌的高效治疗手段,随着对肿瘤研究的不断深入,对于中晚期NSCLC的一线治疗方案正在由传统化疗逐渐转化为更具个体化的基因治疗。目前用于预测NSCLC的发生发展,以及对于药物耐药性的分子标记物研究已经取得了重大进展。分子标记物可以区分非小细胞肺癌患者对于某类药物的化疗敏感性,从而为患者选择最优治疗方案。DNA的内源性及外源性损伤在肺腺癌的发生和发展中起至关重要的作用。在所有的DNA损伤类型当中,DNA双链断裂(DNAdouble-strand breaks, DSBs)是最为严重、最为危险的,且未修复的DSBs会导致基因的不稳定以及肿瘤的发生。对于DSBs的修复主要通过DNA非同源末端连接(nonhomologous end joining,NHEJ)和 DNA 同源重组(homologous recombination, HR)两种方式。NHEJ 修复机制在哺乳动物细胞中起主要作用,该修复机制是由DNA蛋白激酶催化亚基(catalytic subunit of DNA protein kinase,DNA-PKcs )、Ku 蛋白、X 射线修复交叉互补蛋白 4 (X-ray cross complementing 4,XRCC4)以及 DNA 连接酶Ⅳ等一系列催化亚基共同作用完成的。异质二聚体Ku抗原作为DSBs的分子探测器,由分子量为70kDA (Ku70)和80kDA (Ku80)两个亚基组成,且Ku蛋白可以直接结合DNA末端来激活DNA-PK。Gu et al报道称当细胞抑制DNA-PK或者Ku80表达,DNA损伤修复系统就无法继续进行修复工作。Ma et al指出Ku80蛋白可以降低铂类药物对于肺腺癌细胞的损伤,敲除Ku80基因可以提高肺腺癌细胞的放疗及化疗敏感性。然而,绝大多数研究取材于手术后患者的肿瘤标本进行分析,而在肺腺癌患者新辅助化疗开始之前,Ku80是否能够预测顺铂、培美曲塞联合化疗的化疗敏感性,至今未知。本研究通过在基因以及蛋白水平上检测ⅢA期肺腺癌患者组织中Ku80的表达情况,探索并确定肺腺癌中Ku80表达水平与患者临床特征以及新辅助化疗疗效的相关性。体外实验中,分别用短发卡RNA(small hairpin RNA,shRNA)和互补DNA (complementary DNA, cDNA)来抑制和上调Ku80的表达,探索Ku80的表达情况对顺铂、培美曲塞联合介导的细胞凋亡的影响。本研究旨在探讨Ku80是否能够预测ⅢA期肺腺癌患者接受顺铂、培美曲塞联合化疗的敏感性,从而为ⅢA期肺腺癌的治疗提供新的思路。第一部分Ku80在肺腺癌组织的表达以及临床意义目的1.检测Ku80在肺腺癌组织的表达情况2.分析肺腺癌组织Ku80表达水平的高低与临床病理特征以及新辅助化疗疗效的相关性方法1.对2013年9月到2016年9月所有在山东大学附属省立医院胸外科就诊的肺癌患者进行支气管镜检查,病理学证实为肺腺癌且临床分期为ⅢA期的110名患者入选本课题。没有患者接受过化疗、放疗以及靶向治疗。所有病人都接受相同的一线新辅助化疗方案两个周期(顺铂联合培美曲塞),通过CT评估患者的疗效。2.所有肿瘤标本均来自于支气管镜活检,运用免疫组化和实时定量PCR(qRT-PCR)技术来检测110位肺腺癌患者组织中Ku80mRNA和蛋白的表达水平。结合患者临床资料以及患者的化疗疗效,应用SPSS19.0进行数据分析,采用X2检验探讨Ku80表达水平的高低与患者临床病理特征的关系以及Ku80表达情况对于患者化疗敏感性的影响。结果110位ⅢA期肺腺癌患者根据化疗疗效,38人判定为化疗有效(34.5%),72人判定为化疗无效(65.5%)。38位化疗有效患者的肺腺癌组织中Ku80 mRNA相对表达水平显著低于72位化疗无效患者的肺癌组织(3.612±2.392,7.981±2.684;p0.05)。化疗有效组的肺腺癌组织中Ku80免疫组化评分也显著低于化疗无效组(2,079±1.617, 5.597±2.114;p0.05)。卡方检验显示 Ku80mRNA 以及蛋白水平的表达与患者的肿瘤大小、淋巴结转移以及化疗敏感性相关(p0.05),而与患者的年龄、性别以及吸烟情况无明显相关性。结论1.同化疗疗效较好的患者相比,疗效差的患者Ku80在肺癌组织中表达显著增高。2.肺腺癌患者的恶性临床病理特征与Ku80在mRNA和蛋白水平的表达情况密切相关。第二部分靶向抑制或上调肺腺癌细胞Ku80的表达水平对细胞生物学行为以及对于顺铂联合培美曲塞化疗敏感性的影响目的1.探索Ku80基因对于肺腺癌A549细胞系生物学功能的影响。2.明确特异性沉默以及上调肺腺癌细胞Ku80的表达对于体外顺铂联合培美曲塞化疗敏感性的影响方法1.构建靶向沉默Ku80 shRNA和过表达Ku80 cDNA慢病毒载体,并转染肺腺癌细胞得到Ku80沉默A549细胞系以及Ku80过表达A549细胞系。运用qRT-PCR以及Western blot方法检测Ku80基因沉默及过表达效果。2. CCK8检测转染与未转染的A549细胞的增殖能力,绘制细胞生长曲线。按梯度配置联合化疗药物细胞培养基,应用CCK-8检测联合化疗药物对于转染及未转染的A549细胞活性的影响。运用Transwell实验和细胞划痕实验测定抑制或者上调Ku80的表达水平对于A549细胞迁移和侵袭能力的影响。流式细胞术探索转染前后A549细胞对于同一浓度联合化疗药物所致凋亡比率的差异。结果1.选择3个最佳siRNA序列,由上海吉凯基因化学技术有限公司构建包含相应shRNA的相应GV115慢病毒载体:shRNA86、shRNA87、shRNA89,同时根据scramble序列,构建相应慢病毒载体作为阴性对照。shRNA以及scramble序列转染A549细胞后,细胞状态良好,转染率超过80%。2.由上海吉凯基因化学技术有限公司制备Ku80过表达cDNA介导的慢病毒载体以及其相应的空病毒作为阴性对照。Ku80-cDNA及相应对照病毒载体转染A549细胞后,细胞状态较好,转染率大于80%。3.qRT-PCR检测结果表明:正常A549细胞Ku80mRNA相对表达量为1,感染shRNA-scramble、shRNA86、shRNA87 以及 shRNA89 的 A549 细胞 Ku80 mRNA的相对表达量为 1.083±0.15、0.534±0.17、0.663±0.13 以及 0.916±0.11。感染空病毒以及Ku80-cDNA的A549细胞Ku80 mRNA相对表达量为1.051±0.112、2.231±0.194。其中,在下调Ku80基因表达的shRNA序列中,shRNA86转染后A549细胞的Ku80mRNA相对表达量最低,相对于其阴性对照组差异显著(p0.05)。Ku80-cDNA转染的A549细胞Ku80 mRNA的相对表达量明显高于其阴性对照组及正常未进行转染的A549细胞,说明Ku80-cDNA可以显著增加A549细胞的Ku80 mRNA表达。4.Western blot检测慢病毒转染效率:正常A549细胞Ku80蛋白的相对表达量为1,感染 ShRNA-scramble、shRNA86、shRNA87 以及 shRNA89 的 A549 细胞 Ku80蛋白的相对表达量为 0.892±0.15、0.033±0.029、0.072±0.009 以及 0.530±0.061。感染空病毒以及Ku80-cDNA的A549细胞Ku80蛋白的相对表达量为1.083±0.182、2.102±0.574。抑制Ku80蛋白表达的shRNA序列当中,shRNA86转染后A549细胞的Ku80表达量最低,与其阴性对照组相比具有显著差异(p0.05)。所以选择shRNA86转染的A549细胞进行后续实验。同时,Ku80-cDNA转染的A549细胞Ku80蛋白的相对表达量明显高于其阴性对照组及正常未进行转染的A549细胞,说明Ku80-cDNA可以显著增加A549细胞的Ku80蛋白表达。5. CCK8结果显示抑制Ku80表达后,A549细胞的增殖能力与正常细胞相比明显降低,而上调Ku80表达后A549细胞的增殖能力明显提高。shRNA-scramble转染的A549细胞以及空病毒转染的细胞与正常细胞相比,增殖能力无明显变化。6.浓度梯度体外联合化疗测试结果显示,同正常A549细胞相比,shRNA转染的A549细胞对于联合化疗药物的化疗敏感性明显增强,而Ku80-cDNA转染的A549细胞对于该联合化疗药物的敏感性显著降低。shRNA-scramble转染后的A549细胞以及空病毒转染后的A549细胞较正常A549细胞对于联合化疗药物的敏感性无明显差异。7.划痕实验显示shRNA转染的A549细胞迁移能力明显低于未转染A549细胞,而cDNA转染后较转染前A549细胞的迁移运动能力明显增强。相应阴性对照组同未转染A549细胞相比,迁移能力无明显区别。8. Transwell结果证实,shRNA感染后A549细胞的侵袭能力相对于未转染细胞显著降低,而cDNA转染后侵袭能力明显增强,二者相应阴性对照组与未转染的A549细胞的侵袭能力无明显差异。9.流式细胞检测表明,对于同一浓度的联合化疗药物,shRNA转染后的A549细胞凋亡率明显增加,而cDNA转染后的A549细胞凋亡率明显下降。其相应的两个对照组与正常A549细胞的凋亡率无明显差异。结论1.抑制Ku80基因的表达可以显著降低肺腺癌细胞增殖、运动、迁移、侵袭能力,并增加其对顺铂联合培美曲塞化疗的敏感性2.过表达Ku80基因可以增加肺腺癌细胞增殖、运动、迁移以及侵袭能力,并显著增强其对顺铂联合培美曲塞化疗的耐药性。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R734.2

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