HBx在代谢应激条件下对肝癌细胞存活的调控和机制研究

发布时间：2018-10-23 21:09

【摘要】：第一部分HBx在代谢应激条件下对肝癌细胞存活的调控和机制研究研究目的原发性肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是世界六大常见恶性肿瘤之一,其病死率高居世界第二位。虽然手术切除和肝移植是治疗HCC的有效手段,但大多数的患者发现时多为晚期,已经无法再进行手术治疗。在我国,虽然肝癌发生的诱因很多,但慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染与肝硬化以及肝癌的发生发展有密切的关系,是肝癌发生的最主要的危险因素。HBV感染的肝癌患者一般经历病毒感染、肝硬化和肝癌的三个主要阶段。虽然目前研究众多,但HBV感染后如何进一步导致肝癌的发生,或者说HBV在肝癌发展过程中起到什么作用仍不清楚。目前已知HBV基因组中开放式阅读框架X区编码的x蛋白(HBx)是一种大小约17k Da、可溶性的多功能蛋白。其可以通过与宿主细胞内多种功能蛋白以间接或直接的方式相互作用,或者通过反式激活的方式参与调控基因转录、信号转导、增殖凋亡、周期改变等多个细胞病理生理过程。有研究证实HBx在HBV相关肝癌的发生发展过程中起到了非常重要的作用。然而HBx通过怎样的机制、并以如何的方式参与调控肝癌的发生和发展过程却仍有待进一步研究。癌基因的异常过度活化以及抑癌基因的抑制失活会引起细胞代谢重编程。对于肿瘤细胞而言,最常见的代谢表型改变是糖酵解水平的增强:即细胞通过大量消耗葡萄糖进行无氧糖酵解进而为细胞存活和增殖提供必须的能量。但同时由于代谢重编程导致对营养物质、尤其是葡萄糖的高消耗和肿瘤相对生长过快引起的血供不足,肝癌细胞往往长时间处于慢性的相对缺氧、营养物质相对缺乏的代谢应激环境中。这种情况下,肿瘤细胞需要调整其自身代谢方式,从而适应恶劣的外界环境和应激刺激。其中,有学者发现肿瘤细胞可通过增强脂肪酸氧化过程来为细胞在应激条件下的存活提供必需的能量和代谢底物。既往也有研究证实,HBx能够调控脂质代谢并参与肝癌发生发展过程,但在代谢应激尤其是糖缺失的情况下,HBx如何调控肝癌细胞的代谢方式以及在维持肝癌细胞存活等方面起到怎么样的作用,却鲜有研究报道。结合上述问题,本研究全面系统地研究了HBx在减糖代谢应激的情况下维持肝癌细胞存活的调控途径和相应的作用机制,并进一步在动物体内模型和临床肝癌标本中模拟体内环境进行了充分的验证,相关研究在国内外暂时未看到详细的报道。因此,我们的研究将有助于进一步阐明HBx在HBV相关肝癌的进展过程中所起到的作用和意义,也从脂质代谢的角度上为HBV相关肝癌的防治提供了新的思路。研究方法1、建立HBx过表达,以及在过表达细胞系基础上si RNA干扰HBx表达的肝癌细胞系,并在RNA水平和蛋白水平验证效果;2、分别在不同营养应激条件下培养上述肝癌细胞系,比较过表达HBx在不同的处理条件下对肝癌细胞存活率的影响;3、分别在正常培养和减糖应激的情况下通过体外克隆形成实验比较肝癌细胞在过表达HBX之后克隆形成、细胞存活能力的差异;4、分别在正常培养和减糖应激的情况下研究HBx过表达后对细胞内ROS水平、GSH含量、NADPH水平以及ATP含量的影响;5、通过代谢流量仪检测HBx过表达后在正常情况下对肝癌细胞糖酵解能力和线粒体氧化呼吸能力的影响,以及在减糖应激情况下对细胞脂质进行氧化分解的潜能;6、通过蛋白免疫印迹法检测在减糖应激情况下HBx过表达对肝癌细胞AMPK信号通路的活化的情况;7、通过流式细胞术检测在减糖应激情况下HBx表达对胞内钙离子含量水平的影响,以及蛋白免疫印迹法检测给予钙离子通道抑制剂后HBx对AMPK信号通路的活化情况的影响;8、通过裸鼠皮下成瘤以及腹腔给药抑制脂质氧化代谢的实验检测HBx体内成瘤性以及脂质代谢在HBx相关肿瘤发生发展中的作用;9、临床肝癌标本中检测HBx表达、AMPK信号通路活化程度以及脂质氧化分解水平之间的相关性。结果1、HBx的表达可促进肝癌细胞在减糖应激的情况下的存活,但不影响细胞在无谷氨酰胺或无血清情况下的存活能力;2、在减糖应激情况下HBx过表达可控制细胞ROS水平,维持GSH和NADPH含量;3、HBx过表达可增强肝癌细胞在H2O2以及缺氧诱导氧化应激情况下的抗氧化能力;4、在减糖应激情况下HBx过表达可维持胞内ATP含量,保持能量稳态平衡;5、在正常培养情况下HBx过表达并不能影响肝癌细胞糖摄取、乳酸生成、糖酵解以及线粒体氧化呼吸功能;6、在减糖应激情况下HBx过表达增强AMPK信号通路的磷酸化水平,并激活脂质氧化分解途径;7、HBx介导的脂质氧化分解增强可为肝癌细胞提供能量和代谢底物,进而促进其在减糖应激条件下存活;8、在减糖应激情况下HBx过表达主要通过激活Ca2+/Ca MKK轴来促进AMPK信号通路的活化;9、在体内环境中HBx过表达可促进肿瘤形成和发展,但抑制脂质氧化过程可逆转HBx过表达肝癌细胞的体内成瘤优势;10、在临床肝癌样本中HBx的表达量与AMPK信号通路以及脂质氧化分解过程的激活程度明显相关。结论本研究发现HBx在代谢应激的情况下可以通过激活脂质氧化分解过程来提供ATP和NADPH以维持胞内能量和氧化还原稳态,进而维持肝癌细胞在减糖应激情况下的存活情况。即具体分子机制为,HBx在代谢应激情况下通过激活Ca2+/Ca MKK轴来活化AMPK信号通路,进而增强脂质氧化分解途径。体内成瘤实验进一步证实抑制脂质氧化分解可逆转HBx介导的生长优势,同样在临床肝癌样本中也发现HBx的表达水平与AMPK通路以及脂质氧化分解途径的活化程度密切相关。第二部分乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-Co A carboxylaseα,ACCα)介导的脂质从头合成促进肝癌细胞在代谢应激条件下存活的研究研究背景和目的原发性肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是全世界致死率最高的三大恶性肿瘤之一,其恶性程度非常高、预后也极差,5年内患者的复发率甚至能高达70%。很多病人发现时已是晚期,无法手术治疗,只能采用放疗或靶向治疗。虽然随着诊断和治疗技术的不断提高,肝癌的早期诊断和治疗已取得了较大进展,但由于肝癌在临床表现以及生物学特性上有非常大的异质性,难以根据肿瘤特性进行分类分型以利于指导治疗,因此大多数的肝癌患者的临床治疗效果并不理想,患者预后仍较差。鉴于此,根据肝癌的某方面或者某些方面的生物学性质对其进行亚群分型或者分类来指导肿瘤治疗则显得十分迫切。从代谢角度来看,很多肿瘤细胞往往表现出某些共同的代谢表型,比如糖酵解途径的增强。但更多的是不同肿瘤表现出不同类型的异常代谢特征。已有研究表明,很多情况下肿瘤细胞代谢表型的改变多伴有相应癌基因或抑癌基因的异常突变。其中,由癌基因介导的脂质代谢重编程已逐渐引起人们兴趣并被认为是肿瘤细胞重要的代谢异常表型之一。因此,进一步深入了解由这些基因引起的代谢异常表型将有助于科学家们更好的对肿瘤细胞以代谢特征来进行分群,从而也促进肿瘤治疗新药和新靶点的研究与开发。在体内实体恶性肿瘤的形成和进展过程中,肿瘤细胞由于糖酵解大量消耗营养物质并且血供相对不足,所以处于长期应激的微环境。这样不利的存活条件往往需要肝癌细胞改变其自身的代谢模式,进而不断获得维持自身存活下去的能量和代谢底物,最终逐渐适应这样的外界微环境。已有研究证实肝癌细胞的脂质代谢能力增强,并促进肝癌的进展。然而,在代谢应激的环境下,脂质合成代谢是怎样影响肝癌生物学特性、以及这种代谢特征对肝癌细胞在应激状态下的存活起到什么样的作用仍有待进一步阐明。本课题研究的主要目的是探讨在营养应激的微环境下脂质合成代谢途径对肝癌细胞存活的影响以及其具体的调控机制,进而找到并通过代谢表型来对不同的肝癌患者进行分型分类。同时,我们的研究也从脂质代谢途径为肝癌的个性化治疗提供了新的分子靶点和研究思路。实验方法1、从临床肝癌样本中分离原代肝癌细胞,通过流式细胞术方式检测细胞脂质含量和糖摄取能力;2、在减糖应激处理24小时的情况下检测原代肝癌细胞存活率,分别与其脂质含量和糖摄取水平进行相关性分析;3、通过外源性脂肪酸摄取实验检测肝癌细胞对外源脂质摄取利用情况;4、在体外培养肝癌细胞系,通过去除FBS模拟无外源性脂质的情况,利用外源性棕榈酸代替FBS,分别在有糖和无糖的情况下检测有无外源性棕榈酸对脂质合成的影响以及对细胞存活的影响;5、在原代肝癌细胞中通过蛋白免疫印迹实验检测ACCα表达水平,并分别将其跟胞内脂质、糖摄取能力、减糖应激情况下存活能力进行相关性分析;6、建立稳定过表达和干扰ACCα的肝癌细胞系,检测ACCα干扰或过表达对细胞脂质含量、糖摄取能力以及在减糖应激情况下的存活能力的影响;7、通过细胞代谢流量分析仪检测ACCα干扰或过表达后肝癌细胞在减糖应激情况下利用脂质进行氧化分解的能力;8、分别在正常情况和应激状态下通过免疫共沉淀方法检测肝癌细胞中内源性和外源性ACCα与CPT1A之间的相互作用;9、分离胞内线粒体,分别在正常和应激情况下检测CPT1A在胞内和线粒体定位的含量变化;10、通过DEN诱癌大鼠和小鼠模型检测ACCα在肝癌中的表达情况,以及对脂质含量和糖摄取能力的影响;11、通过免疫组化检测肝癌样品芯片中癌组织以及对应癌旁组织中ACCα的表达含量,在患者中分析ACCα表达与不同临床恶性表型之间的关系;12、分析ACCα对肝癌患者总体生存期还有无瘤生存期的影响,单因素以及多因素分析ACCα在判断肝癌患者复发以及预后中的意义。实验结果1、肝癌细胞脂质含量主要来自于经过葡萄糖来源的从头合成的过程;2、肝癌细胞中脂质从头合成水平具有较大异质性,而这种从头合成的能力与肝癌细胞在减糖应激情况下的存活情况密切相关;3、肝癌细胞中ACCα的表达水平决定了其脂质从头合成水平的异质性,并与肝癌细胞在减糖应激情况下的存活能力密切相关;4、干扰ACCα表达可抑制肝癌细胞通过利用葡萄糖进行脂质的从头合成,并使肝癌细胞对减糖应激引起的细胞死亡更敏感,而过表达ACCα则可以促进脂质从头合成并保护细胞在减糖应激情况下存活;5、ACCα的过表达或干扰并不能直接影响肝癌细胞对外源性脂肪酸的摄取和转运;6、在营养应激饥饿处理的情况,ACCα的表达可以改变肝癌细胞利用脂质进行氧化分解的能力;7、ACCα可以与脂质氧化分解关键酶CPT1A相互作用,并且在减糖应激情况下两者相互作用减弱,从而使释放游离的CPT1A重新定位结合在线粒体膜上,进而促进脂质氧化分解过程;8、ACCα在DEN诱癌的大鼠和小鼠模型的肝癌组织样品中有较高的表达,并能促进恶性转化的肝癌细胞利用葡萄糖通过从头合成途径合成脂质;9、ACCα高表达的临床肝癌样本更具有侵袭性的生物学特性和临床表型;临床肝癌标本中ACCα高表达可以显著促进肝癌的发生、进展以及恶性侵袭;10、ACCα高表达是影响肝癌患者术后无瘤生存期和总生存期的重要独立危险因素,ACCα的表达水平能够作为肝癌患者复发和预后的有效预测指标。结论本研究发现在肝癌细胞中脂质含量主要来自于利用葡萄糖进行的脂质从头合成途径,而非直接摄取外源性脂肪酸进行加工合成。同时,肝癌细胞中脂质从头合成水平有较大的异质性,并且与肝癌细胞在代谢应激情况下的存活能力密切相关。在分子层面上,我们发现脂质合成关键限速酶ACCα的表达一定程度上决定了这种脂质从头合成的水平,并且与细胞在应激情况下存活能力密切相关。即ACCα在正常培养条件下可促进脂质合成并储存,而在减糖应激状态下可促进脂质氧化分解供能利用细胞存活。其具体机制是,ACCα可以与脂质氧化分解关键限速酶CPT1A相互结合,并在减糖应激环境下结合作用降低,游离的CPT1A重新定位于线粒体进而激活脂质氧化途径。我们进一步在DEN诱癌模型中证实ACCα在肿瘤组织中高表达并能促进恶性转化肝癌细胞利用葡萄糖进行脂质从头合成。最后在肝癌临床样本中,ACCα的高表达与肿瘤临床恶性、侵袭性病理特征表型密切相关,并且ACCα高表达的患者其更容易复发、生存时间更短、预后更差。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7

【参考文献】