IGFBP2调节胰腺癌转移及侵袭的机制及其临床意义

发布时间：2018-10-24 09:21

【摘要】：背景和目的:检测IGFBP2蛋白在胰腺癌患者血清和肿瘤组织中的表达状况,结合患者临床病理资料评估IGFBP2蛋白作为胰腺癌诊断和预后判读标记物的可能性;观察IGFBP2对胰腺癌细胞迁移侵袭等生物学行为的影响,探讨IGFBP2蛋白影响胰腺癌细胞侵袭转移的具体机制。方法:1.分别收集健康志愿者,慢性胰腺炎患者和胰腺癌患者治疗前的血清标本,使用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中IGFBP2的表达水平,分析IGFBP2蛋白在各队列中的差异性表达,再结合临床病理参数和ROC曲线评估比较IGFBP2与CA19-9在不同亚组患者中的表达情况和诊断效力,对病例资料进行随访观察,根据不同IGFBP2蛋白表达水平作生存分析;再对肿瘤组织进行IGFBP2蛋白免疫组化染色,并结合临床病理资料分析肿瘤组织中IGFBP2与临床病理参数之间的关系并根据不同IGFBP2蛋白表达水平作生存分析;2.构建IGFBP2过表达质粒和干扰RNA、观察不同IGFBP2表达水平对胰腺癌细胞株形态和生物学行为的影响,利用Western Blot和免疫荧光技术检测干扰与过表达IGFBP2后胰腺癌细胞EMT关键基因在蛋白水平的表达以及细胞定位情况;使用IGFBP2过表达稳转细胞构建胰腺癌原位裸鼠模型,评估IGFBP2对胰腺癌细胞侵袭转移能力的影响;3.使用c DNA微阵列技术对比IGFBP2稳定过表达胰腺癌细胞和野生型胰腺癌细胞的基因表达差异,并通过信号通路分析软件IPA预测可能被激活的信号通路(本试验发现NF-κB被激活);分别提取细胞核和细胞浆蛋白,Western Blot检测IGFBP2过表达和下调后NF-κB激活情况并使用免疫荧光进行细胞定位检测,在临床样本组织切片中进行IGFBP2,NF-κB的p65亚基和EMT重要基因进行免疫组化染色,观察各指标表达是否具有相关性。最后联合应用IGFBP2重组蛋白、各信号通路抑制剂,基因修饰MEF细胞,PTEN突变质粒及双荧光素酶实验研究IGFBP2激活NF-κB的可能机制。结果:1.ELISA检测发现IGFBP2在胰腺癌中(435.7±234.2 ng/ml)较慢性胰腺炎(233.0±59.80 ng/ml)和健康人(289.9±148.2 ng/ml)明显表达升高(P值均0.05),并且该差异性在对年龄和性别进行校准后依然存在。IGFBP2根据患者临床资料进行亚组分析发现,IGFBP2较CA19-9在伴发糖尿病情况,淋巴结转移和神经侵犯各亚组有明显差异,ROC曲线显示IGFBP2联合CA19-9较二者单独使用可以明显提高胰腺癌的诊断率(AUC值0.921),且IGFBP2较CA19-9能更好的鉴别慢性胰腺炎和胰腺癌(AUC值0.817 vs0.770,P0.05);IGFBP2升高是胰腺癌预后的独立预后指标,以333.9ng/ml为截断值,Kaplan-Meier曲线发现IGFBP2升高患者预后明显较差(中位生存期13月vs 8月,P0.05)。通过对上述队列胰腺癌组织病理切片的IGFBP2蛋白免疫组化染色发现,71例(94.6%)病理切片中胰腺癌细胞IGFBP2蛋白表达阳性;Logistic回归分析显示:胰腺癌组织中IGFBP2蛋白表达与淋巴结转移,生存时间相关,生存分析显示免疫组化间质细胞染色评分大于6分的患者生存期与评分小于6分的患者相比有显著性差异(中位生存期9月vs 16.1月,P0.05)。2.细胞形态学及生物学行为观察结果显示:与对照组相比,胰腺癌IGFBP2过表达细胞形态明显由上皮细胞形态向间质细胞形态转变,且细胞迁移(P0.05)及侵袭能力增强(P0.05);而IGFBP2下调后细胞形态呈明显上皮样改变,细胞迁移侵袭能力减弱;两组细胞增殖未见明显改变;IGFBP2上调后,E-cadherin和Vimentin呈上皮-间质样定量定位改变,而IGFBP2下调则呈相反改变;动物胰腺癌原位模型显示IGFBP2过表达促进肿瘤细胞发生肠系膜根部转移。3.c DNA微阵列显示IGFBP2过表达后,上皮间质转化的重要基因Snail,Vimentin,Ecadherin在转录水平呈明显EMT转化趋势改变,信号通路分析显示IGFBP2激活后NF-κB信号通路可能被激活(P0.001)。免疫荧光及核蛋白的Western Blot显示IGFBP2上调后,核内的p65亚基及其磷酸化形式明显增多,NF-κB被激活并伴随E-cadherin的减少和Vimentin的增多,相反IGFBP2下调后核p65明显减少NF-κB激活受到抑制伴随E-cadherin的增多和Vimentin的减少,临床样本连续切片组化染色提示IGFBP2与p65,E-cadherin和Vimentin表达明显相关。NF-κB被抑制后,IGFBP2升高也无法引起EMT和细胞侵袭迁移能力的增加。当PTEN/PI3K/Akt通路被抑制或IKKβ被敲除后,IGFBP2无法引起p65入核进而激活NF-κB引起EMT。结论:1.IGFBP2在胰腺癌患者血清和肿瘤组织中特异性升高,其升高程度与肿瘤淋巴结转移,神经侵犯以及预后相关,是一种对诊断胰腺癌和判断患者预后有价值的生物标记物。2.IGFBP2升高会引起胰腺癌细胞侵袭转移能力增强,这种现象是通过诱导胰腺癌细胞发生上皮间质转化(EMT)所致。IGFBP2是通过激NF-κB信号通路进而诱导EMT发生的。3.IGFBP2是通过抑制同源性磷酸酶-张力蛋白(PTEN)表达,激活PI3K/Akt信号通路,继而磷酸化激活IKK激酶β(IKKβ),磷酸化降解NF-κB阻扼蛋白I-κB,促进p65入细胞核激活NF-κB。
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【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.9

【共引文献】