Kif2a基因沉默对脑胶质瘤细胞生物学行为的影响及机制研究

发布时间：2018-10-26 12:11

【摘要】：前言脑胶质瘤是人类中枢神经系统最常见的肿瘤之一,在成人和儿童50-60%的颅内肿瘤都是脑胶质瘤,脑胶质瘤发生率大概6.42例/100000。脑胶质瘤患者5年存活率不到30%。虽然脑胶质瘤的治疗方法有了长足的进展,但是高级别脑胶质瘤恶性程度较高,治疗疗效却没有显著改善。脑胶质瘤易复发、转移的这种生物学行为越来越受到广泛关注,因此,进一步探索研究与脑胶质瘤侵袭转移相关的新的机制,对深入进行脑胶质瘤综合治疗,提高患者预后有重要意义。研究表明细胞骨架在肿瘤侵袭转移过程中发挥重要作用,其主要成分微管的减少及解聚与恶性肿瘤的转移有关。而驱动蛋白在微管解聚和聚合过程中起到重要作用。驱动蛋白超家族具有马达催化区和ATP结合区,能转化水解ATP的化学能成机械能。驱动蛋白超家族可参与细胞内转运、染色体分离、有丝分裂、纺锤体和中体形成等胞内重要的生命过程。随着研究深入,迄今为止发现了45种驱动蛋白,分为14个家族。其中Kinesin-13家族蛋白主要参与细胞的有丝分裂,特别是纺锤体形成,染色体和核运动及胞质分裂过程。研究证实Kinesin-13家族成员之一Kif2a能通过解聚微管蛋白的功能,在调控双极纺锤体的形成、中心纺锤体长度及方向过程中及抑制神经元中副侧枝的延伸过程中发挥重要作用。过度激活或抑制Kif2a可影响染色体间微管长度,紊乱中心染色体,导致有丝分裂异常。近年来,一些研究机构相继发现Kif2a在口腔癌、乳腺癌及结直肠癌组织中表达上调。并在口腔癌、乳腺癌等肿瘤细胞的迁移和侵袭过程中发挥重要作用。但迄今为止,Kif2a在脑胶质瘤中的表达及及其与肿瘤的侵袭转移关系尚不明确。本研究首次探讨了Kif2a基因在脑胶质瘤组织中的表达情况；并通过体外实验研究了Kif2a基因在脑胶质瘤细胞迁移,侵袭,增殖和凋亡中的作用及分子机制；最后初步探讨了Kif2a基因和在肿瘤发生转移过程中起到非常重要作用的HIF1α基因的关系。实验结果表明Kif2a基因在脑胶质瘤细胞的迁移,侵袭,增殖和凋亡过程中有发挥了重要的作用。鉴于Kif2a基因在脑胶质瘤的发生和转移过程中的重要作用,提示可将其作为脑胶质瘤治疗的新的潜在靶点。第一部分Kif2a在脑胶质瘤中的表达及意义目的研究Kif2a在脑胶质瘤组织中的表达及临床意义。方法标本收集：收集辽宁医学院附属第一医院2008～2013年间原发性脑胶质瘤组织标本35例,另收集2014年山东大学齐鲁医院神经外科住院患者手术切除的新鲜脑胶质瘤组织35例,作为实验组。且所有患者术前均未进行放疗、化疗等其他治疗,并与患者或监护人签署实验知情同意书后进入实验进行研究。同时取20例正常尸检的脑组织标本做为对照组。所有入组组织标本按照WHO(2000)标准进行分级,Ⅰ-Ⅱ级15例,Ⅲ-Ⅳ级20例；男23例,女12例；平均年龄(4-70岁)。1.应用免疫组化法检测高级别的脑胶质瘤组织和正常脑组织,不同级别的脑胶质瘤组织Kif2a蛋白的表达情况。探讨在高级别脑胶质瘤组织和正常脑组织及不同级别的脑胶质瘤组织中Kif2a蛋白的表达情况及相互关系。2.应用Real-time PCR法检测新鲜脑胶质瘤组织中Kif2a的mRNA表达情况与临床病理参数的关系。探讨在不同级别脑胶质瘤组织中Kif2a的mRNA表达情况及相互关系。结果免疫组化结果显示35例高级别脑胶质瘤组织和20例正常脑组织中都有Kif2a的阳性表达,与正常脑组织比较,高级别脑胶质瘤组织表达率高于正常脑组织,且有统计学差异(P=0.001)。免疫组化检测35例不同级别的脑胶质瘤组织,高级别脑胶质瘤组织表达率高于低级别脑胶质瘤(P=0.044)。Kif2a蛋白主要表达在胞质及胞核,呈棕黄色颗粒,在高级别脑胶质瘤细胞胞浆中染色较强,在低级别脑胶质瘤细胞和正常脑组织细胞中染色较浅。Real-time PCR法检测新鲜胶质瘤组织中Kif2a的mRNA表达。Kif2a表达随着脑胶质瘤级别增高而增强(P=0.033)。结论Kif2a在高级别脑胶质瘤中强表达,在低级别脑胶质瘤和正常脑组织弱表达。Kif2a的表达水平与脑胶质瘤的病理分级,临床分期相关。第二部分Kif2a基因沉默对脑胶质瘤A172增殖、凋亡、侵袭/迁移的影响目的探讨siRNA介导的Kif2a基因沉默对脑胶质瘤A172细胞系细胞增殖、凋亡及侵袭迁移能力的影响；探讨Kif2a基因沉默后抑制人胶质瘤细胞生长、侵袭及转移的分子机制。方法1.人脑胶质瘤细胞株筛选：脑胶质瘤细胞系A172和U251细胞常规进行复苏,传代,获取细胞,37℃,5%CO2饱和湿度条件下,在含10%胎牛血清和DMEM培养液中培养,提取A172和U251细胞的总RNA,逆转录成cDNA,进行PCR扩增,确定人脑胶质瘤A172细胞作为研究对象。2.质粒干扰率的测定：将细胞分Kif2a siRNA组和scrambled siRNA对照组,将对数生长期的A172细胞以2×105数目接种于6孔培养板中。用脂质体liPofectamine2000分别转染Kif2a siRNA和scrambled siRNA。转染后48h,收集细胞,提取细胞总RNA和总蛋白,应用RT-PCR方法检测不同实验组中Kif2a的基因表达。应用Western-blot方法检测不同实验组中Kif2a的蛋白表达。分析不同实验组中A172细胞Kif2a的基因、蛋白表达情况。评价Kif2a siRNA组干扰效率。3.利用CCK8检测Kif2a基因沉默对脑人胶质瘤细胞系A172细胞增殖能力的影响：分别将指数生长期A172-Kif2a siRNA组和对照组细胞消化计数后按1×104个/孔接种于96孔细胞培养板中,培养3天,于第0、24、48和72h,采用CCK8方法检测各组细胞增殖情况。4.流式细胞术检测Kif2a基因沉默对人脑胶质瘤细胞系A172细胞的凋亡率变化：取各组细胞消化计数后按2×105/孔接种于12孔板中,待细胞融合至约80%,收集细胞,Annexin V和PI染色后流式细胞仪检测细胞凋亡率变化。5.Transwell小室细胞侵袭实验检测Kif2a基因沉默对人脑胶质瘤细胞系A172细胞侵袭迁移能力的影响。取各组无血清A172细胞悬液100μL加入小室的上室,下室加入600μl含10%胎牛血清的DMEM培养液,培养16h。光镜下计数侵袭到滤膜背面的穿膜细胞数,评价细胞的侵袭迁移能力。6.明胶酶谱法检测Kif2a基因沉默对人脑胶质瘤细胞A172细胞MMP2、MMP9的表达的影响。7.Western blot检测Kif2a基因沉默对人脑胶质瘤细胞系A172细胞PI3K/AKT和MAPK/ERK信号通路的影响。8.Western blot检测Kif2a基因沉默对人脑胶质瘤A172细胞MMP2、MMP9蛋白表达的影响。结果1. Kif2a siRNA能够有效下调Kif2a的表达。qRT-PCR检测Kif2a siRNA敲除24h,48h时A172细胞中Kif2a的表达,发现48h的敲除效率高(P=0.003)。Western blot进一步验证A172细胞中Kif2a siRNA较对照组敲除48h时的效率高。2.CCK8法检测Kif2a敲除对A172细胞增殖的影响。发现随着时间延长,A172细胞Kif2a siRNA敲除组增殖率显著低于对照组。3. Annexin V/PI法检测Kif2a siRNA及scrambled siRNA两组敲除48h时A172细胞凋亡率。发现Kif2a敲除组较对照组相比,Kif2a敲除组显著上调A172的凋亡率(P0.0001)。4.Tanswell小室细胞侵袭实验结果显示Kif2a siRNA敲除组A172细胞侵袭/迁移显著低于对照组。5.明胶酶谱检测发现Kif2a siRNA敲除组上清中MMP2、MMP9的活性显著低于scrambled siRNA组。6.Western blot分析发现Kif2a siRNA敲除组中,与胶质瘤细胞侵袭、迁移相关的AKT磷酸化水平下调；MMP2蛋白表达水平下调。与胶质瘤细胞增殖相关的p38MAPK磷酸化水平下调。结论1.Kif2a siRNA能够有效的抑制A172细胞中Kif2a的表达,Kif2a基因沉默后A172细胞增殖、侵袭和迁移能力明显降低,凋亡水平升高。2.Kif2a通过PI3K/AKT和MAPK/ERK信号转导通路在脑胶质瘤细胞的恶性生物学行为中起着重要的作用。3. Kif2a通过MMP调控人脑胶质瘤的侵袭转移能力。第三部分HIFla在脑胶质瘤中的表达和意义及和Kif2a的关系目的研究HIFla在脑胶质瘤组织中的表达及临床意义,并分析其与Kif2a之间的关系。方法收集山东大学齐鲁医院神经外科2013-2014年住院患者手术切除的新鲜脑胶质瘤组织35例,所有标本病理证实是人脑胶质瘤组织并制备成石蜡切片,所有患者均为原发性,术前未行放疗、化疗和其他治疗,所有患者及监护人被告知进行实验。所有患者组织标本诊断按照WHO(2000)标准进行分级,Ⅰ-Ⅱ级15例,Ⅲ-Ⅳ级20例；男23例,女12例；平均年龄(4-70岁)。应用免疫组化法检测不同级别的脑胶质瘤组织HIF1α蛋白的表达情况。检测在不同级别的脑胶质瘤组织中HIF1α蛋白的表达情况,并探讨Kif2a与HIF1α在脑胶质瘤组织中表达相关性。结果1.HIF1α蛋白表达与临床资料之间的关系。免疫组化结果显示HIF1α蛋白主要在细胞核和细胞浆中染色。35例脑胶质瘤组织中HIF1α蛋白的阳性表达率是68.6%,20例Ⅲ-Ⅳ脑胶质瘤切片中,17(85.3%)例表达阳性,3(14.7%)例阴性表达。15例Ⅰ-Ⅱ脑胶质瘤切片中,7(46.7%)例表达阳性,8(53.3%)例阴性表达。HIF1α蛋白在Ⅰ-Ⅱ低级别和Ⅲ-Ⅳ高级别脑胶质瘤表达有差异性(P=0.027)。HIF1α在脑胶质瘤中的表达随着肿瘤级别增高而成上升趋势(P0.05),HIF1α在脑胶质瘤表达与患者年龄,性别、肿瘤大小及发生部位无关。2.Kif2a和HIF1α蛋白在脑胶质瘤组织中表达相关性。免疫组化检测脑胶质瘤中Kif2a和HIF1α蛋白表达无差异性(P=0.33)。结论HIF1α蛋白在高级别脑胶质瘤中强表达,在低级别脑胶质瘤弱表达。HIF1α的表达水平与脑胶质瘤的病理分级,临床分期相关。HIF1α蛋白可作为评价脑胶质瘤临床指标的一个重要因子。Kif2a和HIF1α蛋白在脑胶质瘤的转移过程中均可能化起到正调控作用,但两者之间可能不存在相关性,其机制尚待进一步研究明确。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.4

【共引文献】