血小板靶向载体系统的制备及其抗血液肿瘤效应的研究

发布时间：2018-10-30 16:46

【摘要】：第一部分功能化血小板载体装载显像剂靶向成像体内异种种植瘤目的:众多学者研究发现血小板能够进入肿瘤微环境中与肿瘤细胞相互作用,并且在肿瘤微环境中起着至关重要的作用。因此,本文尝试在血小板内部装载显像剂、在血小板表面联接外源性的能够靶向识别特定肿瘤细胞的蛋白或抗体分子,来制备功能化血小板靶向载体。功能化血小板靶向载体能够靶向识别体内的特定肿瘤细胞并更多地聚集于肿瘤微环境中,从而达到对体内肿瘤部位靶向成像的目的。方法:制备功能化血小板靶向载体的步骤如下:1)血小板首先摄入kabiramideC(KabC)形成KabC-血小板,利用流式细胞仪定量优化KabC的最佳反应浓度,并用激光共聚焦显微镜和扫描及透射电子显微镜定性观察KabC-血小板的形态。2)稳定的KabC-血小板进一步摄取能够通过细胞膜的化合物形成载药KabC-血小板。本文中采用的化合物包括表阿霉素(Epidoxorubicin,EPI)、5(6)-羧基荧光素二乙酸酯(CarboxyfluoresceinDi-ester,CFDA)、二氢卟吩E6(ChlorinE6,CE6),利用流式细胞仪定量优化各化合物的最佳反应浓度,并用激光共聚焦显微镜定性观察载药KabC-血小板的形态。3)在载药KabC-血小板的表面利用化学键联接上外源性的能靶向识别特定肿瘤细胞(人多发性骨髓瘤细胞RPMI8226和人慢性髓原白血病细胞K562)的转铁蛋白分子(Transferrin,Tf),并联接上荧光分子以获得功能化血小板靶向载体。利用流式细胞仪定量优化制备功能化血小板靶向载体的最佳反应条件,并用激光共聚焦显微镜定性观察功能化血小板靶向载体的形态及其在体外与RPMI8226和K562细胞之间的相互作用。4)利用动物活体成像仪观察功能化血小板靶向载体在荷皮下和颅内肿瘤细胞种植瘤的小鼠体内的分布规律,并用激光共聚焦显微镜观察功能化血小板靶向载体在颅内RPMI8226细胞种植瘤的组织切片内的分布。结果:KabC能够有效地抑制血小板胞浆内肌动蛋白的聚合反应,使得血小板在制备过程中不发生特异性或非特异性的变形或聚集形成血栓。稳定的KabC-血小板能够在胞浆内装载多种化合物,并且其表面能够被联接上外源性的转铁蛋白分子和荧光分子。激光共聚焦显微镜动态观察结果表明,表面标记转铁蛋白分子和荧光分子的血小板靶向载体KabC-血小板-Cy5 Tf能够特异性粘附在表面高表达转铁蛋白受体的肿瘤细胞RPMI8226和K562细胞表面。活体成像观察结果表明,KabC-血小板-Cy7Tf在荷异种种植瘤的小鼠体内的半衰期可达144 h,显著增加了识别目标细胞的几率,能够特异性聚集在体内种植瘤部位,并且能够显像早期体积较小的颅内RPMI8226细胞种植瘤。结论:KabC-血小板不易发生变形或聚集,是一种新型、稳定的天然药物载体,在其内部装载其他药物或显像剂,同时在其表面联接靶向蛋白分子或荧光分子后可以靶向成像体内特定肿瘤。第二部分功能化纳米血小板载体装载显像剂和药物靶向成像及治疗体内异种种植瘤目的:第一部分论文中的功能化血小板靶向载体虽然能够高效地靶向特定肿瘤组织,却不易释放出其内容物,并且因体积较大而不能被靶细胞内吞。因此,需要采取额外的措施促使其在肿瘤微环境中释放出药物达到杀伤肿瘤细胞的目的,比如通过装载光动力学化合物CE6在血小板内产生氧自由基从而破坏血小板膜释放出药物。在本部分论文中,从缩小血小板体积使其能够被靶细胞内吞的角度出发,通过超声粉碎的方式将完整血小板制成一种新型的生物纳米载体——纳米血小板靶向载体。功能化纳米血小板靶向载体能够靶向识别特定肿瘤细胞并被其内吞,从而将显像剂或细胞毒性药物递送进肿瘤细胞内,达到对肿瘤组织进行靶向成像及治疗的目的。方法:按第一部分论文中的方法制备获得KabC-血小板后,再通过温和的超声处理使其被粉碎成KabC-纳米血小板,利用流式细胞仪、动态光散射仪和扫描及透射电子显微镜表征KabC-纳米血小板的大小和结构。用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪优化功能化纳米血小板靶向载体(载药KabC-纳米血小板-Tf)的制备条件。用激光共聚焦显微镜观察人多发性骨髓瘤细胞RPMI8226与KabC-纳米血小板-Cy5 Tf之间的相互作用。用流式细胞仪检测载表阿霉素(Epidoxorubicin,EPI)的KabC-纳米血小板-Tf能否被肿瘤细胞所内吞及诱导细胞发生凋亡;用活体成像仪检测KabC-纳米血小板-Cy7Tf在荷瘤小鼠体内的分布规律;最后观察载EPI的KabC-纳米血小板-Tf对小鼠皮下RPMI8226细胞种植瘤的生长抑制作用,通过对瘤组织进行病理切片分析验证载EPI的KabC-纳米血小板-Tf能否在体内靶向识别特定的肿瘤细胞并诱导肿瘤细胞发生凋亡。结果:KabC-纳米血小板的平均直径约70～250nm,膜结构完整,含有与其母细胞KabC-血小板相似的内容物,也能够在胞浆内装载具有膜通透性的药物(KabC、EPI),并在表面联接上外源性蛋白分子(转铁蛋白,Tf)和荧光分子(Cy5-NHS、Cy7-NHS)。激光共聚焦显微镜观察发现,KabC-纳米血小板-Cy5 Tf能够特异性地靶向表面高表达转铁蛋白受体分子的RPMI8226细胞,并且被RPMI8226细胞所内吞。流式细胞仪检测结果表明,RPMI8226细胞内吞靶向载体EPI-KabC-纳米血小板-Tf的量约是内吞非靶向载体EPI-KabC-纳米血小板量的2.5倍,EPI-KabC-纳米血小板-Tf对RPMI8226细胞的凋亡诱导作用强于EPI-KabC-纳米血小板,从而证明内吞作用是通过转铁蛋白与转铁蛋白受体之间的特异性结合来实现的。动物活体成像结果表明KabC-纳米血小板-Cy7Tf能够靶向显像小鼠体内RPMI8226细胞种植瘤。对小鼠背部皮下RPMI8226细胞种植瘤的重量及瘤组织切片的分析结果表明,EPI-KabC-纳米血小板-Tf能靶向识别RPMI8226细胞并诱导其凋亡,抑制皮下瘤的生长。结论:功能化纳米血小板作为一种新型的生物纳米载体可以靶向成像特定的肿瘤组织,也可将抗肿瘤药物靶向递送至肿瘤部位或其他疾病组织,从而达靶向治疗疾病的目的。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.5

【相似文献】