小分子化合物DMBT对乳腺癌血管生成拟态的作用及机制研究

发布时间：2018-10-30 18:41

【摘要】：乳腺癌是严重危害女性健康的最严重的恶性肿瘤之一。其最重要的特点是肿瘤细胞容易发生侵袭转移,这也成为导致临床治疗失败的主要原因。在临床确诊的恶性肿瘤病人中,50%以上的患者其原发瘤已经发生转移。肿瘤的侵袭和转移是一个多步骤复杂连续过程,在这一过程中,肿瘤的生长和转移与新生血管形成关系密切,新生血管在为肿瘤的生长提供营养和氧气的同时带走代谢产物,并且使原发瘤细胞进入血液循环到达靶器官,为肿瘤的转移提供了必要条件。传统的观点认为肿瘤血供模式主要分为血管发生和血管生成两种,而两者的共同特点是都依赖血管内皮细胞。以往的抗血管生成治疗主要是以内皮细胞作为靶点,而对恶性肿瘤自身围成的血管生成拟态(vasculogenic mimicry, VM)结构未加以考虑。VM是一种不依赖内皮细胞的全新的肿瘤供血方式,即高侵袭性的肿瘤细胞在特定微环境中通过自身变形围成的管道结构。VM常位于肿瘤内部,与病人预后明显负相关。但是目前对VM的研究尚处于初级阶段,许多导致VM形成的分子机制也不十分明确。现已知许多因素都可影响VM的形成,例如缺氧的肿瘤微环境,细胞外基质重塑,肿瘤干细胞,上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition, EMT)等。肿瘤细胞的快速生长和增殖需要消耗大量的营养和氧气,由于新生血管尚未形成,氧气供应不足,肿瘤细胞处于急性或慢性缺氧状态。而缺氧的微环境可以通过刺激许多信号分子的产生或过表达促进肿瘤VM的形成,例如HIF-1α、VE-Cadherin、MMPs、VEGF等,其中HIF-la可通过启动一系列信号通路促进VM的发生。这也是乳腺癌治疗难以突破的一个瓶颈,目前临床常用的抗血管生成药物主要以内皮细胞做为靶点,然而在肿瘤的临床治疗中该类分子靶向抑制剂对肿瘤的治疗作用不理想。因此,研发抗乳腺癌血管生成拟态的新型治疗药物是目前亟待解决的问题。海藻糖衍生物Brartemicin,结构为6,6’-双-2,4-二羟基-6-甲基苯甲酸酯-α,α-D-海藻糖,是日本科学家Igarashi从放线菌Nonomuraea sp.代谢产物中分离得到的。我院药化所刘兆鹏教授对Brartemicin的分子进行结构改造,构建了一系列不同的海藻糖衍生物。经筛选,发现化合物6,6’-双(2,3-二甲氧基苯甲酰基)-a,a-D-海藻糖(6,6'-bis (2,3-dimethoxybenzoyl)-a, a-D-trehalose, DMBT)抗肿瘤侵袭转移活性较好且毒性较低。但其抗侵袭转移作用是否和VM有关还不清楚。本课题通过体内、外实验,研究化合物DMBT对人乳腺癌血管生成拟态的作用,并研究其分子机制,以期得到有效的抗乳腺癌VM药物。实验方法：利用连二亚硫酸钠营造肿瘤缺氧的微环境,MTT法及克隆形成实验用来检测连二亚硫酸钠的适宜浓度,Western blotting实验检测VM相关蛋HIF-1a,VE-cadherin, MMP-2, MMP-9, VEGE等的表达,用来选定连二亚硫酸钠合适的作用时间。划痕实验和Transwell实验检测缺氧组及DMBT组对乳腺癌细胞MDA-MB-231及MCF-7细胞的侵袭和迁移能力的影响。体外3D培养观察缺氧组及DMBT组对两种乳腺癌细胞VM形成能力的影响。PAS/CD34双染法观察DMBT体内抗VM形成能力。Western blotting实验检测缺氧以及缺氧加DMBT对两种乳腺癌细胞VM相关蛋白表达的影响。实验结果：MTT法及克隆形成实验选定连二亚硫酸钠1 mmol和0.5 mmol分别作为制造乳腺癌MDA-MB-231及MCF-7细胞缺氧微环境的适宜浓度。Western blotting实验显示,在MDA-MB-231细胞中,随着连二亚硫酸钠作用时间的延长,HIF-1α, VE-cadherin, MMP-2, MMP-9和VEGE等表达逐渐增多,而在MCF-7细胞中,VM相关蛋白在4小时表达最多,之后逐渐减少。因此选定连二亚硫酸钠1 mmol作用24 h以及0.5 mmol作用4h分别作为MDA-MB-231和MCF-7细胞的缺氧条件。划痕实验以及Transwell实验显示,缺氧能够促进两种细胞的迁移和侵袭能力,而DMBT能够抵抗这种现象。体外3D培养发现缺氧能够促进两种细胞的VM形成能力,而DMBT可以有效抑制缺氧环境下的VM形成。PAS/CD34双染显示DMBT在1mg/kg、10mg/kg可明显抑制肿瘤组织中的VM形成。Western blotting实验显示,在MDA-MB-231细胞中,DMBT能够抑制缺氧环境下HIF-1α, VE-Cadherin, MMP-2, MMP-9, Rac1及Cdc42的表达。在MCF-7中,DMBT对VE-Cadherin, MMP-2, VEFG的表达无影响,但可以抑制HIF-la, Beclinl, Rac1及Cdc42的表达,同时增加mTOR的表达。结论：缺氧的微环境可以促进高、低侵袭性的乳腺癌MDA-MB-231细胞以及MCF-7细胞的侵袭转移以及VM形成,缺氧环境下DMBT能够在两种细胞内通过不同的作用机制逆转这种现象。在MDA-MB-231细胞内,DMBT主要通过抑制HIF-1 α/VE-cadherin/MMPs信号通路抑制VM的形成,而对VEGF作用不明显。在MCF-7细胞,缺氧对HIF-la, VE-cadherin的影响较小,主要通过对自噬相关蛋白Beclinl,mTOR的调节来促进VM, DMBT通过抑制Beclin1,促进mTOR的表达抑制自噬,进而抑制MCF-7细胞的VM形成。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.9

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