MicroRNA-19b在坏死性胰腺炎及胰腺导管腺癌中的作用及机制研究

发布时间：2018-10-31 14:14

【摘要】：急性胰腺炎发病率近年来呈不断上升的趋势,新修订的亚特兰大标准将急性胰腺炎分为间质水肿性胰腺炎和坏死性胰腺炎。坏死性胰腺炎是指胰腺实质或胰腺周围组织的坏死,单纯胰腺组织坏死约占5%,单纯胰腺周围组织坏死约占20%,大部分患者同时合并胰腺及胰腺周围组织坏死。三种类型的坏死性胰腺炎均可为无菌性炎症,也可伴发感染。坏死性胰腺炎约占急性胰腺炎的10-20%,胰腺坏死与感染、器官功能障碍等诸多并发症相关,导致并发症发生率及死亡率明显增加,因此患者总体预后差。急性胰腺炎的自然病程主要分为以炎症反应为主要特征的第一阶段以及以感染和脓毒血症为主要特点的第二阶段。坏死并发感染会使患者死亡率明显升高。因此,在急性胰腺炎第一阶段通过实验室检查或临床指标早期评估患者预后,对高风险的患者采取积极的治疗措施,减少胰腺腺泡细胞坏死,对于改善患者的预后具有重要意义。MicroRNAs (miRNA)是一种单链非编码RNA,长度约为18-25nt,可通过与目的基因3'-UTR区结合抑制基因翻译或促进其降解,从而降低目的蛋白表达水平。miRNA虽然只占人类基因组的1%,但可调控约60%的蛋白表达基因。目前研究表明miRNA可参与细胞多种重要的生命活动过程,包括增殖、分化及凋亡等;此外,miRNA在炎症、肿瘤等疾病中也发挥重要作用。但目前尚无miRNA在坏死性胰腺炎中的作用报道。本研究通过构建体内坏死性胰腺炎模型,经miRNA芯片筛选与胰腺腺泡细胞坏死明显相关的miRNA,进一步验证该miRNA在腺泡细胞坏死中的具体作用,并对其机制进行初步探索。为将miRNA应用于坏死性胰腺炎的诊断及治疗提供初步证据。[目的]筛选与坏死性胰腺炎相关的miRNA,并验证其在胰腺腺泡细胞坏死中的作用及机制,为将miRNA应用于坏死性胰腺炎的诊断及治疗提供依据。[方法]1. 通过L-精氨酸腹腔注射构建坏死性胰腺炎SD大鼠模型,经HE染色检测模型是否构建成功;经miRNA芯片筛选与坏死性胰腺炎相关的miRNA。2.通过牛磺石胆酸-3-硫酸醋二钠盐(Taurolithocholic Acid 3-sulfate Disodium Salt,TLC-S)处理胰腺腺泡细胞构建坏死性胰腺炎细胞模型,检测淀粉酶含量验证模型是否构建成功。3 .在体外模型组及体外对照组AR42J细胞中转染mimic miR-19b、miR-19b antisense oligonucleotide (miR-19b ASO)及阴性对照(negative control, NC),qRT-PCR验证miR-19b表达量改变;检测转染后各组AR42J细胞坏死率。4. qRT-PCR检测间质水肿性胰腺炎患者、坏死性胰腺炎患者及健康查体者临床血液标本中miR-19b含量,验证其与坏死性胰腺炎的关系。5. qRT-PCR检沏测转染 mimic miR-19b、miR-19b ASO 及 NC 的 AR42J 细胞中 IL-1β、IL-6 及 TNFα 的 mRNA 变化。[结果]1. HE染色检测发现L-精氨酸处理组大鼠有大量腺泡细胞坏死,说明坏死性胰腺炎SD大鼠模型构建成功,命名为体内模型组,对照组命名为体内对照组;经miRNA芯片筛选发现miR-19b表达量与坏死性胰腺炎明显相关。2.淀粉酶含量检测发现TLC-S处理组AR42J细胞培养基上清中淀粉酶含量明显升高,证明坏死性胰腺炎细胞模型构建成功。构建成功的坏死性胰腺炎细胞模型命名为体外模型组, 对照组命名为体外对照组。3.经qRT-PCR检测发现mimic miR-19b组miR-19b表达量较NC组明显升高,miR-19bASO组miR-19b表达量较NC组明显降低。在体外模型组细胞中mimic miR-19b组细胞坏死率较NC组明显升高,miR-19b ASO组细胞坏死率较NC组明显降低。4. qRT-PCR检测临床血液标本中miR-19b含量发现间质水肿性胰腺炎患者miR-19b含量较健康对照组明显升高;坏死性胰腺炎患者miR-19b含量明显高于间质水肿性胰腺炎患者及健康对照组。 5.经 qRT-PCR 检测转染 mimic miR-19b、miR-19b ASO 及 NC 的 AR42J 细胞中IL-1β、IL-6及TNFαmRNA变化。结果显示相对于NC组细胞,mimicmiR-19b组 IL-1β、IL-6 及 TNFαmRNA 含量均明显升高,而 miR-19bASO 组 IL-1β、IL-6及TNFα mRNA含量均明显均明显降低[结论]1. miR-19b可促进坏死性胰腺炎患者腺泡细胞坏死的发生。2. miR-19b可通过调节IL-1β、IL-6及TNFαmRNA水平介导坏死性胰腺炎炎症反应,进而促进胰腺腺泡细胞坏死。胰腺导管腺癌(Pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)是临床上肿瘤致死的主要原因之一,其起病隐匿、转移出现早,约80%的患者在就诊时已失去手术机会,手术患者术后复发率高、预后差,患者总体5年生存率低于6%,行手术切除并联合辅助治疗的患者中位生存时间仅24个月,明显低于其他实体肿瘤患者中位生存时间。目前手术切除的PDAC患者主要的辅助治疗方案是以吉西他滨为主的化疗;近年研究报道对于出现转移的PDAC患者采用联合化疗方案可延长患者生存时间,联合化疗反应率为23-31%,患者无病生存时间为5.5-6.6个月,总体生存时间为8.5-11个月。由此可见,联合化疗PDAC患者预后仍很差,且联合化疗使不良反应率显著增加,明显降低患者生活质量。早期诊断和早期切除是目前延长患者生存时间最为有效的方法;PDAC预后不良与肿瘤异质性高、对化疗不敏感有直接关系,因此通过进一步研究PDAC发生发展机制,寻找早期诊断标志物及更为有效的治疗靶点对改善患者预后具有重要意义。MicroRNAs (miRNA)是非编码的小RNA,可直接作用于靶向mRNAs抑制其翻译或增加其降解从而降低表达水平。miRNA可作为调控细胞增殖、分化及凋亡的关键节点,在肿瘤细胞中异常表达可成为重要的促癌或抑癌因子,影响肿瘤对化疗反应率。miRNA靶向药物被视为肿瘤治疗重要措施。miR-19b是miR-17-92集簇的重要促癌因子,研究表明其在乳腺癌、肺癌及胃癌等多种肿瘤中可通过直接作用于TP53、PTEN等重要抑癌基因发挥促癌功能,并可作为判断患者预后的指标;miRNA结构稳定,可通过血液标本检测,其在肿瘤早期诊断中的价值也受到越来越多的重视。但miR-19b在PDAC中的作用尚未明确。本研究主要探索miR-19b在PDAC细胞增殖、转移的作用及机制,以进一步明确PDAC发生发展的机制,同时为其早期诊断及治疗提供新的思路。第一节miR-19b在PDAC增殖及转移中的作用研究[目的]检测miR-19b在PDAC细胞系及病人血液标本中的表达量,并研究miR-19b在PDAC细胞增殖、迁移及侵袭中的作用。[方法]1.通过qRT-PCR检测人胰腺导管正常上皮细胞HPDE、人PDAC细胞系PANC1、MiaPaCa2、BxPC3及人PDAC转移细胞系COL0357、FG中miR-19b的表达水平,初步探索miR-19b在PDAC中的功能。2.收集山东大学齐鲁医院和河南省人民医院63例PDAC患者及50例健康查体者血液标本,通过qRT-PCR检测健康对照组及PDAC患者血液标本中miR-19b表达水平,进一步验证miR-19b在PDAC中的功能。 3.构建miR-19b稳定高表达及低表达细胞系。通过Transwell小室细胞迁移实验和Matrigel细胞侵袭实验验证miR-19b沉默和高表达的PDAC细胞迁移和侵袭能力改变,明确miR-19b对PDAC细胞迁移和侵袭能力的影响。4.通过MTT实验和克隆形成实验检测miR-19b沉默及高表达后PDAC细胞增殖能力的变化,并通过Western blotting进一步检测PDAC细胞增殖标志物p21及p27在miR-19b沉默及高表达后表达量改变,明确miR-19b对PDAC细胞增殖能力的影响。[结果]1. qRT-PCR检测结果显示人胰腺导管正常上皮细胞HPDE中miR-19b表达量明显低于人PDAC细胞系PANC1、MiaPaCa2、BxPC3及转移细胞系COL0357、FG中miR-19b的表达水平,说明miR-19b在PDAC中可能具有促癌作用。2.通过qRT-PCR检测63例PDAC患者及50例健康查体者血液标本中miR-19b表达水平发现PDAC患者血液中miR-19b表达水平明显高于健康对照组,进一步说明miR-19b在PDAC中具有促癌作用。3.通过Transwell小室细胞迁移实验和Matrigel细胞侵袭实验验证miR-19b沉默的PDAC细胞迁移和侵袭能力明显下降,miR-19b高表达的PDAC细胞迁移和侵袭能力显著增强,说明miR-19b可增强PDAC细胞迁移和侵袭能力。4.通过MTT实验和克隆形成实验检测发现miR-19b沉默能够明显降低PDAC细胞增殖能力,miR-19b高表达可明显增强PDAC细胞增殖能力;Western blotting结果显示miR-19b沉默后PDAC细胞增殖标志物p21及p27表达量明显升高,miR-19b高表达后p21及p27表达量显著降低。上述结果证实miR-19b可增强PDAC细胞增殖能力。[结论]1.miR-19b可促进PDAC细胞迁移和侵袭;2.miR-19b可增强PDAC细胞增殖能力。第二节miR-19b促进PDAC细胞转移能力的机制研究[目的]肿瘤转移是造成PDAC患者死亡最为主要的原因,上述研究中我们已经证实miR-19b可促进PDAC细胞侵袭和迁移,本部分研究中我们将进一步探索miR-19b增强PDAC细胞侵袭和迁移能力的具体机制。[方法]1.经Western blotting检测miR-19b沉默和高表达后PDAC细胞肿瘤干细胞特性标志物(CD133、c-Met、FOXM1)的表达改变,并经sphere formation实验检测miR-19b沉默和高表达后PDAC肿瘤干细胞自我更新能力的变化,探索miR-19b是否通过影响PDAC细胞肿瘤干细胞特性促进细胞迁移和侵袭。2.经microRNA.org和TargetScan预测miR-19b的靶向mRNA,结合前期研究报道中PDAC肿瘤干细胞特性调控常见分子和信号通路,筛选miR-19b影响PDAC细胞肿瘤干细胞特性的可能分子;经Western blotting检测miR-19b高表达后所预测分子蛋白表达水平改变,选择蛋白表达水平降低的分子进一步验证其功能。3.在miR-19b高表达的PDAC细胞中转染所选择的靶基因cDNA以增强其表达水平,通过Western blotting检测该基因高表达是否能够逆转miR-19b高表达后PDAC细胞肿瘤干细胞特性标志物(CD133、c-Met、FOXM1)的表达增强,并经sphere formation实验检测该基因高表达是否能够逆转miR-19b高表达后PDAC肿瘤干细胞自我更新能力的增强。4.经Tanswell小室细胞迁移实验和Matrigel细胞侵袭实验证实所选择的基因高表达能否逆转miR-19b高表达引起的细胞迁移和侵袭能力增强。[结果]1.经Western blotting检测证实miR-19b沉默后PDAC肿瘤干细胞特性标志物(CD133、c-Met、FOXM1)的表达明显降低,miR-19b高表达后PDAC细胞肿瘤干细胞特性标志物(CD133、c-Met、FOXM1)的表达明显增强;经sphere formation实验检测可见miR-19b沉默后PDAC肿瘤干细胞自我更新能力明显降低,可见miR-19b高表达后PDAC肿瘤干细胞自我更新能力明显增强。说明miR-19b可能通过增强PDAC细胞肿瘤干细胞特性促进细胞迁移和侵袭。2.经microRNA.org和TargetScan预测miR-19b的靶向mRNA,并结合前期研究报道中PDAC细胞肿瘤干细胞特性调控常见分子和信号通路,筛选出3个miR-19b影响PDAC细胞肿瘤干细胞特性的可能分子SOX2、PTEN及ABCG2;经Western blotting检测miR-19b高表达后SOX2、PTEN及ABCG2表达改变,结果发现只有PTEN蛋白表达水平下降,说明miR-19b可能通过靶向作用于PTEN进而影响PDAC细胞肿瘤干细胞特性。3.通过Western blotting检测发现PTEN高表达能够明显逆转miR-19b高表达后PDAC细胞肿瘤干细胞特性标志物(CD133、c-Met、FOXM1)的表达增强,经sphere formation实验检测PTEN高表达能够逆转miR-19b高表达后PDAC肿瘤干细胞自我更新能力的增强。结果说明miR-19b可通过降低PTEN表达进而促进PDAC细胞肿瘤干细胞特性。4.经Tanswell小室细胞迁移实验和Matrigel细胞侵袭实验证实PTEN高表达能够逆转miR-19b高表达引起的细胞迁移和侵袭能力增强。说明miR-19b可通过靶向作用于PTEN降低其表达进而增强PDAC细胞肿瘤干细胞特性,并进一步促进PDAC细胞侵袭和迁移能力。[结论]1.miR-19b可通过增强PDAC肿瘤干细胞特性促进肿瘤转移;2.PTEN可介导miR-19b对PDAC肿瘤干细胞特性及转移的调控作用。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R576;R735.9

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