HSP90β和Enterolactone影响FAK调控乳腺癌细胞侵袭转移的实验研究

发布时间：2018-10-31 15:07

【摘要】：第一部分HSP90β稳定FAK调控乳腺癌细胞侵袭转移研究目的：HSP90是一种高度保守的分子伴侣,它通过参与顾客蛋白的折叠、成熟与降解过程而调节相关信号转导途径；作为一种重要的酪氨酸激酶,FAK尚未被认为是HSP90的顾客蛋白。本课题通过检测HSP90p与FAK之间是否存在相互作用,以及它们之间相互作用的机制,寻找与肿瘤发生相关的HSP90新的客户蛋白,探讨FAK在MDA-MB-231乳腺癌细胞中调节细胞生长、迁移和侵袭的机理,从而提供与HSP90抑制剂相组合的潜在药物,以及为研发靶向蛋白质-蛋白质相互作用的抗癌药物提供理论依据。研究方法：1.通过构建质粒,采用免疫共沉淀、GST Pull-down、免疫荧光等方法研究HSP90β和FAK的相互作用；2.利用HSP90抑制剂17-AAG处理乳腺癌细胞,利用CHX阻断细胞内蛋白质的合成,观察HSP90β对FAK稳定性的影响；以17-AAG和MG-132单独或共同处理MDA-MB-231细胞,用FAK抗体进行免疫共沉淀泛素蛋白,检测FAK是否经过泛素／蛋白酶体途径被降解；3.通过建立稳定细胞系、Soft-agar实验、细胞划痕实验、Transwell实验和细胞骨架染色实验,检测HSP90β和FAK被抑制后对乳腺癌MDA-MB-231细胞的生长和侵袭转移的影响。研究结果：1.成功构建HSP90β全长以及三个结构域突变体(蛋白N端1-232片断、中端233-620片断、C端621-724片断)的表达质粒。2.免疫共沉淀证实内源性和外源性的HSP90β与FAK之间存在相互作用,免疫荧光实验表明在MDA-MB-231和H4细胞中,HSP90β与FAK存在明显的共定位。3.HSP90 β的第233-620位氨基酸区间是与FAK相互作用的主要结合位点。4.FAK通过蛋白酶体途径被降解,HSP90β能稳定FAK蛋白避免其降解。5.FAK的抑制剂PF-573228和HSP90的抑制剂17-AAG能明显抑制MDA-MB-231细胞生长、迁移和侵袭；利用RNA干涉技术特异性抑制FAK或HSP90β的表达减少MDA-MB-231细胞的生长和迁移。6.PF-573228和17-AAG干扰MDA-MB-231和H4细胞的细胞骨架而影响细胞迁移。研究结论：1.HSP90β与FAK存在相互作用,HSP90β的中间结构域是与FAK蛋白结合的主要结构域。2.HSP90β能稳定FAK蛋白。没有HSP90的保护,FAK将经过蛋白酶体依赖的途径被降解,表明FAK应该是HSP90的一个新客户蛋白。3.HSP90β可以调控FAK信号途径,并在促进乳腺癌细胞的生长和转移过程中起着重要的作用。4.FAK或HSP90β抑制剂对乳腺癌细胞表现出降低细胞生长和转移的相似作用,为肿瘤的治疗提供了一种新的途径。第二部分Enterolactone对乳腺癌细胞生长和转移的抑制作用研究目的：富含木酚素的食物已被证实能降低患乳腺癌的风险。已报道木酚素的活性代谢物肠内酯(Enterolactone, ENL)有抗雌激素受体(ER)阴性乳腺癌的作用,但ENL影响乳腺癌细胞生长和转移的机制还不太清楚,本实验的目的是研究ENL抗肿瘤的分子机制。研究方法：1.MTT法检测ENL对MDA-MB-231细胞增殖的影响,流式细胞仪检测ENL对细胞周期的影响,Q-PCR检测ENL对细胞增殖和细胞周期相关基因表达的影响,Western blot检测FAK磷酸化。2.通过细胞划痕实验、Transwell实验和细胞骨架染色实验,观察ENL对MDA-MB-231细胞迁移、侵袭和细胞骨架的影响。研究结果：1.ENL能抑制MDA-MB-231生长,并呈现药物浓度和时间梯度依赖性,ENL作用于MDA-MB-231细胞48h的IC50值为261.9±10.5gM。2.ENL诱导细胞周期S期的细胞比例增大。ENL (50 μM、100 μM和200μM)处理48小时后,S期细胞的比例由7.03%分别增加到19.35%、21.67%和28.32%,同时G1和G2/M期细胞的比例减少。3.ENL下调细胞增殖基因Ki67、PCNA和FoxMl的表达。同时细胞周期S、G2/M期相关基因Cyclin E1、Cyclin A2、Cyclin B1和Cyclin B2的表达被抑制,但参与G0/G1期调节的基因CDK4、CDK6和Cyclin D1的表达水平没有明显改变。4.ENL降低FAK及其下游效应蛋白桩蛋白的磷酸化水平。5.ENL干扰细胞骨架,抑制MDA-MB-231细胞迁移和侵袭。研究结论：1.ENL通过抑制细胞增殖基因Ki-67、PCNA和FoxM1的表达影响细胞生长,通过下调细胞周期S、G2/M期相关基因的表达影响细胞周期。2.ENL通过阻断FAK/paxillin信号通路,干扰乳腺癌细胞的细胞骨架而影响细胞迁移能力,提示肠内酯为乳腺癌潜在的抗癌剂。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.9

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本文编号：2302635